【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 骨架成份。(時(shí)偉紅編)實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞生理活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 通過(guò)制片與觀察加深理解細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、吞噬等生理活動(dòng)?！緦?shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 雄性蟾蜍、小白鼠、l％雞血懸液、6％淀粉肉湯、草履蟲(chóng)。 二、器材和儀器 光鏡、2ml注射器、載玻片、蓋玻片、解剖器材、滴管、移液管、試管、玻璃片、黑紙。 三、試劑 ％臺(tái)盼蘭、1％剛果紅?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、細(xì)胞的吞噬活動(dòng) (一)原理 白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)中能游走的單位。它分為粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、淋巴系三類(lèi)。它們有許多生理功能，如游走性、變形運(yùn)動(dòng)、趨化性、吞噬異物等。在白細(xì)胞中，以粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的吞噬活動(dòng)較強(qiáng)，故稱此二類(lèi)細(xì)胞為吞噬細(xì)胞。單核細(xì)胞由血液進(jìn)入組織后逐漸演變成巨噬細(xì)胞。吞噬細(xì)胞主要靠吞噬來(lái)處理異物。吞噬細(xì)胞首先由于趨化作用而向異物游走，然后伸出偽足包圍異物，并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞噬泡將異物吞入細(xì)胞，繼而溶酶體與吞噬泡融合消化異物。 (二)小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活動(dòng)的觀察 l．實(shí)驗(yàn)前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉湯O．5～1ml(含O．3％臺(tái)盼蘭，起標(biāo)記作用)，以刺激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細(xì)胞(此步由教師在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行完畢)。 2．實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組取一只經(jīng)上述處理的小鼠，腹腔注射1％雞血懸液0．5～1ml，注射后輕揉小鼠腹部以使紅細(xì)胞懸液分散均勻。 3．1小時(shí)后，用頸椎脫位法處死小鼠，迅速剖開(kāi)小鼠腹壁，向腹腔注入O．5ml～1ml生理鹽水，用牙簽輕輕攪拌使生理鹽水與腹腔液混勻。 4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后蓋上蓋片。 5．鏡檢，高倍鏡下畫(huà)圖記錄所見(jiàn)結(jié)果。 二、暗視野觀察細(xì)胞的纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng) (一)原理 暗視野照明法是一種不使照射被檢物體的光線直接進(jìn)入物鏡的照明方法。常常用它來(lái)觀察沒(méi)有染色的活體細(xì)胞或膠體粒子。利用此照明法，在鏡檢時(shí)不能直接看到通過(guò)標(biāo)本的照明光線，只有被檢物體反射或衍射的光線進(jìn)入物鏡可以提高分辨率，在暗視野中可以看到明亮的被檢物體的存在和運(yùn)動(dòng)，但它們的內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻看不清楚。 (二)自制遮光板變普通顯微鏡為“簡(jiǎn)單的暗視野顯微鏡”。 步驟：1．將顯微鏡聚光器調(diào)到最高位，用低倍鏡調(diào)焦至清楚。2．取下目鏡，從鏡筒中觀察并調(diào)節(jié)光圈的大小，使其與鏡筒中所見(jiàn)物鏡的視野相等。3．放一塊透明玻璃于載物臺(tái)透光孔上，用尺子測(cè)量光圈孔徑。4．按照?qǐng)D61的形狀，用黑紙剪成與調(diào)節(jié)后光圈孔徑一樣大小的中央遮光板。5．將中央遮光板放置在顯微鏡的濾光框上，即可進(jìn)行標(biāo)本的暗視野觀察。注：如果使用高倍鏡觀察標(biāo)本時(shí)，應(yīng)按高倍鏡調(diào)焦的視野大小重新制作中央遮光板。圖6—1中央遮光板a．光圈孔徑 b．濾光片直徑 (三)觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細(xì)胞的纖毛運(yùn)動(dòng) 步驟： 1．用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。 2．腹部向上將蟾蜍固定在蠟盤(pán)上。 3．沿蟾蜍二側(cè)口角向后剪開(kāi)約l厘米，將下頜翻轉(zhuǎn)固定在腹部。 4．在上頜中線距喉頭1厘米處放置臘屑，觀察臘屑向什么方向移動(dòng)？記錄臘屑開(kāi)始移動(dòng)到消失的時(shí)間(見(jiàn)圖62蟾蜍口腔內(nèi)面圖)。 5．然后，用眼科剪刀剪取咽頭前部的上頜粘膜約22cm2小塊，用牙簽挑取剪下的粘膜，將縱切面貼于載片上。 6．加一滴生理鹽水于載玻片標(biāo)本上，加蓋玻片，鏡檢。圖6—2 蟾蜍口腔內(nèi)面圖 結(jié)果： 1．在低倍鏡下觀察上頜粘膜細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。 2．換高倍鏡仔細(xì)觀察纖毛有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)。 (四)暗視野觀察蟾蜍精子的鞭毛運(yùn)動(dòng) 步驟： l．將前面實(shí)驗(yàn)所用蟾蜍沿腹中線開(kāi)腹，暴露出黃色圓柱狀精巢。 2．剪取一側(cè)精巢于盛有自來(lái)水的平皿中，用鑷子夾住精巢的一端，清洗去血污。 3．移取洗凈的精巢于另一干凈的平皿上，用眼科剪將精巢充分剪碎后，加入數(shù)滴自來(lái)水混勻。 4．用吸管吸取平皿內(nèi)液體，滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，稍待2～3分鐘于鏡下觀察。 結(jié)果： 1．在低倍鏡下可見(jiàn)到視野中有許多精子：頭部呈長(zhǎng)錐形，尾為細(xì)長(zhǎng)的線狀結(jié)構(gòu)。 2．置高倍鏡下觀察：可見(jiàn)有許多靠尾部鞭毛彎曲擺動(dòng)驅(qū)使而運(yùn)動(dòng)的精子，測(cè)量鞭毛長(zhǎng)度。 三、草履蟲(chóng)纖毛運(yùn)動(dòng)及食物泡的形成圖6—3 草履蟲(chóng) 草履蟲(chóng)是一種單細(xì)胞動(dòng)物。蟲(chóng)體由一個(gè)細(xì)胞組成，能執(zhí)行復(fù)雜的生理功能。 其體表，均勻密布纖毛，為運(yùn)動(dòng)細(xì)胞器。身體的前部有口溝，由前端斜向伸至體中部，口溝的底部為胞口，下部一短管斜向后部而入胞質(zhì)，稱胞咽。纖毛有規(guī)律的擺動(dòng)使食物在胞咽聚結(jié)形成食物泡(吞噬泡)，最后脫離胞咽入胞質(zhì)。食物泡隨細(xì)胞質(zhì)由體后端到前端不停環(huán)流，并與溶酶體(含酸性水解酶)融合，行使細(xì)胞內(nèi)消化。 根據(jù)食物泡中剛果紅指示劑的顏色變化(酸性時(shí)，為紅色；近中性時(shí)，為黃色；堿性時(shí)，為藍(lán)色)?？梢杂^察到消化過(guò)程。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1．取一滴草履蟲(chóng)培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)。加蓋玻片，制成臨時(shí)裝片。 2．觀察草履蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)方式(觀察時(shí)光線可調(diào)暗些)：可見(jiàn)鏡下有許多樣似倒置鞋底的草履蟲(chóng)，體表纖毛不斷擺動(dòng)，蟲(chóng)體以其中軸左旋前進(jìn)，若遇阻力則試觸后即刻回避而轉(zhuǎn)向。 3．觀察草履蟲(chóng)的食物泡的形成： 1)在蓋玻片一側(cè)加一滴l％的剛果紅指示劑，用吸水紙從另一側(cè)吸引使指示劑進(jìn)入蓋片下方，選一運(yùn)動(dòng)較遲緩的草履蟲(chóng)，移入高倍鏡觀察吞噬活動(dòng)。 2)幾分鐘后可見(jiàn)草履蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)許多紅色食物泡，隨著食物泡不停的在胞質(zhì)中環(huán)流，食物不斷消化，泡內(nèi)酸性減弱或近中性，顏色漸漸呈黃色，食物泡漸小，最后食物泡顏色呈藍(lán)色，不能被消化的殘?jiān)?，環(huán)流到身體后部的胞肛排出，不排出時(shí)不易見(jiàn)到胞肛。【作 業(yè)】 1．畫(huà)圖記錄細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)所見(jiàn)結(jié)果，小鼠巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)如何解釋細(xì)胞內(nèi)臺(tái)盼蘭的著色？ 2．在觀察細(xì)胞纖毛和鞭毛運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中,記錄一下臘屑從開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到消失的時(shí)間。 3．鞭毛和纖毛有何異同？(朱亞勤編)實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私夂怂?、蛋白質(zhì)、糖及酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理，掌握Brachet反應(yīng)及堿性蛋白、酸性蛋白、糖原和過(guò)氧化物酶的細(xì)胞化學(xué)染色方法?！緦?shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的Hela細(xì)胞。 二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤(pán)、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、水浴箱。 三、試劑PBS緩沖液()、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、純二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、％堿性固綠、％酸性固綠、％硫酸銅、聯(lián)苯胺混合液、1％番紅、無(wú)水乙醇、過(guò)碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亞硫酸水、Ehrlieh蘇木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，體積比)【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 細(xì)胞的組織化學(xué)方法，是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過(guò)顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。 一、Brachet反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA (一)原理 細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍(lán)綠色，呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。由此對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 (二)方法 l．接種Hela細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng)24～48小時(shí)，使長(zhǎng)成單層。 2．取出蓋片，用PBS()輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)? 3．放入Carnoy固定液中固定l小時(shí)。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗2～3次(2～3秒鐘左右)，吸去水分。放入純丙酮中分色2～3秒鐘。 6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒鐘。 7．放入純二甲苯中透明5分鐘。8．滴一滴中性樹(shù)膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片。9．鏡下觀察（三）結(jié)果細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，而其中核仁被染成紫紅色（參照照片）。二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示（一）原理由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。（二）方法1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤(pán)中，剪開(kāi)胸腔，打開(kāi)心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干。2. 將涂片作好標(biāo)記放在70％乙醇中固定5分鐘，室溫晾干。3．放入5％三氯醋酸中60℃30分鐘，抽提出核酸。4．清水沖洗多次（3分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。5．濾紙吸干玻片上水分。6. ％堿性固綠(～)中染色10～15分鐘,％酸性固綠(～)染色5～10分鐘。7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。（三）結(jié)果經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細(xì)胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白質(zhì)存在處（參照照片）。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。 三、細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的顯示（一）原理過(guò)氧化物酶能把許多胺類(lèi)氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)判定過(guò)氧化物酶的有無(wú)或多少。（二）方法1．取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開(kāi)其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜向剪斷，用PBS緩沖液濕潤(rùn)過(guò)的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。2．推片，室溫晾干。3．％硫酸銅中浸30秒~1分鐘。4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)6分鐘。5．清水沖洗，放入1％番紅溶液中復(fù)染2分鐘。6．清水沖洗，室溫晾干。7．鏡檢或封片后鏡檢。（三）結(jié)果涂片中可見(jiàn)一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒，為過(guò)氧化物酶所在位置。 四、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)——顯示細(xì)胞內(nèi)糖原(參照照片和示教片) (一)原理 組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法來(lái)顯示，其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過(guò)碘酸的氧化作用，打開(kāi)碳鏈形成醛，生成的醛基與Schiff試劑中的無(wú)色品紅反應(yīng)形成紫紅色化合物。 (二)方法 l．取l~2mm厚的肝組織塊，用Carnoy氏液4℃固定4～6小時(shí)。 2．乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片。 3．用70％乙醇展片。 4．脫蠟：二甲苯(1)5分鐘→二甲苯(2)5分鐘→100％乙醇5分鐘→含1％火棉膠的乙醇液1分鐘→70％乙醇1分鐘。 5．直接浸入過(guò)碘酸酒精液反應(yīng)5～15分鐘，經(jīng)70％乙醇洗片刻。6．浸入Schiff氏酒精液反應(yīng)15分鐘。 7．亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴(kuò)散的染料。 8．流水沖洗3～5分鐘。 9．蒸餾水洗。 10．浸入Ehrlich蘇木精復(fù)染20~30秒，使細(xì)胞核著色。 11．脫水：95％乙醇3分鐘二次→100％乙醇3分鐘二次→二甲苯透明10分鐘二次。 12．加蓋片鏡檢或樹(shù)膠封固后鏡檢。 (三)結(jié)果 細(xì)胞中呈紫紅的顆粒即為糖原(參照照片)。 五、蘇丹Ⅲ染色——顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪(示教片)【作 業(yè)】1． 用彩色筆繪出Brachet反應(yīng)及PAS反應(yīng)的鏡下所見(jiàn)。2．說(shuō)明著色的堿性蛋白可能是什么物質(zhì)?(紀(jì)曉輝編)實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^(guò)細(xì)胞勻漿和離心的方法分級(jí)分離細(xì)胞的組分，以了解其原理及過(guò)程。【實(shí)驗(yàn)用品】 一、材料和標(biāo)本 小白鼠、冰塊。 二、器材和儀器 玻璃勻漿器、普通離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)、普通天平、光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離心管、滴管、10ml量筒、25ml燒杯、玻璃漏斗、解剖剪、鑷子、吸水紙、紗布、螬盤(pán)、平皿、牙簽。 三、試劑 ／／L氯化鈣溶液、1％甲苯胺蘭染液、％詹納斯綠B染液、％NaCl溶液?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、原理 細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。 分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。 勻漿(Homogenization)低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(／／L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。 分級(jí)分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開(kāi)始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管