【正文】 操作步驟 1．將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。有絲分裂過程包括一系列復雜的核變化，染包體和紡錘體的出現(xiàn)，以及它們平均分配到每個子細胞的過程。 蝗蟲精巢取材方便，標本制備方法簡單，染色體數(shù)日較少，例如，蝗蟲初級精母細胞染色體數(shù)2n=22+X，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四個精細胞，每個精細胞的染色體數(shù)為n=ll+X或n=11(注：蝗蟲的性別決定與人類不同，雌性有兩條X染色體、雄性為XO，即只有一條X染色體，沒有Y染色體)，一般多采用它來研究觀察減數(shù)分裂染色體形態(tài)變化。終變期(Diakinesis) 染色體更為粗短，形成Y、V、O等形狀，終變期末核膜、核仁消失。(謝榮林編)實驗十 正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備【實驗目的】 掌握微量全血培養(yǎng)及正常細胞和腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備技術。用75％酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺面，然后將培養(yǎng)液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超凈臺。 4．輕輕將細胞吹成懸液，加5~6ml固定液，室溫下固定30分鐘。按時終止培養(yǎng)，％％EDTA混合消化液處理單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液。Y染色體被隸屬于該組，短臂無隨體，一般較2l、22號大點。放入37℃水浴中待用。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導I期細胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體。 (3)1000rpm離心5分鐘。1000rpm離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液?！緦嶒炗闷贰? 一、材料 人宮頸癌上皮細胞(HeLa細胞) 二、器材和儀器 顯微鏡、離心機、水浴箱、熱吹風機、10ml刻度離心管、5(1/2) 針頭注射器、試管架、染色槽、廢液缸、吸水紙、擦鏡紙、冰凍載玻片、香柏油瓶、記號筆、酒精燈。目前應用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。A組包括三對，即第1~3號6條染色體，第1號為最大、是中央著絲點，長臂近側(cè)有次縊痕；第2號第二大、著絲點略偏離中央；第3號為三大，是中央著絲點。 腫瘤細胞染色體制備技術在細胞生物學、醫(yī)學遺傳學的基礎研究和臨床診斷、愈后觀察等方面均有廣泛用途。用天平平衡后以1000rpm離心8分鐘，棄大部上清。因此它是細胞生物學及其它學科研究中的一種有效的方法。 4．精子形成 在兩次精母細胞分裂過程中，各種細胞器，如，線粒體、高爾基體等也大致平均地分到四個精細胞中，精細胞經(jīng)一系列的分化成熟為精子。彎曲繞成一團，排列無規(guī)則，染色線上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。 2．植物細胞有絲分裂的觀察——洋蔥根尖切片 將洋蔥根尖切片標本先在低倍鏡下觀察，尋找生長區(qū)，這部分的細胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細胞形狀呈方形。其后無絲分裂又在各種動植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，尤其在分裂旺盛的細胞中更多見，但遺傳物質(zhì)平均分配否?及其分裂的機制尚不十分清楚。 4．將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm，離心15分鐘；(1)緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；(2)同時涂一張上清液片②做好標記，自然干燥；(3)余下的沉淀物進行下一步驟。 (三)結(jié)果 細胞中呈紫紅的顆粒即為糖原(參照照片)。7．鏡檢或封片后鏡檢。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干。 一、Brachet反應一顯示細胞內(nèi)的DNA和RNA (一)原理 細胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應，一般認為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的DNA呈藍綠色，呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。身體的前部有口溝，由前端斜向伸至體中部，口溝的底部為胞口，下部一短管斜向后部而入胞質(zhì)，稱胞咽。 2．腹部向上將蟾蜍固定在蠟盤上。 (二)小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬活動的觀察 l．實驗前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉湯O．5～1ml(含O．3％臺盼蘭，起標記作用)，以刺激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細胞(此步由教師在實驗前進行完畢)。細胞膜與核膜之間為細胞質(zhì)。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum) 人胃壁細胞、恒河猴脊髓前角運動神經(jīng)細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電鏡照片：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在分泌蛋白質(zhì)的細胞中較發(fā)達，在細胞核周圍可見有較密集的膜層結(jié)構即為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它們大都呈片狀排列，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可與細胞核膜相通連。 三、微絲的電鏡照片觀察 恒河猴脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結(jié)構，直徑5～8cm，它均勻地分散于細胞基質(zhì)中，或排列成束和網(wǎng)狀。 ④將蓋片移入3％戊二醛固定15分鐘?！咀? 業(yè)】繪制光鏡下軟骨細胞液泡系。 這有三張線粒體超薄切片的電鏡照片：第一張是小鼠腎小管上皮細胞中線粒體的電鏡照片，可見線粒體呈橢圓形和桿狀，由雙層膜包圍，內(nèi)膜向內(nèi)突起成平板狀脊，脊與線粒體長軸垂直排列，腎小管上皮細胞重吸收作用需要能量，線粒體數(shù)目多?；铙w染色是應用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細胞內(nèi)某些結(jié)構而又很少影響細胞生命活動的一種染色方法。顯微鏡下觀察可見復蓋口腔表面的上皮細胞為扁平橢圓形，中央有橢圓形核，染成蘭色。盡可能拉直肌纖維?！緦嶒炗闷贰恳弧⒉牧虾蜆吮? 蟾蜍一只，人血液一滴。常用來搗髓處死蟾蜍，持法如執(zhí)筆法。然后將解剖針抽回并轉(zhuǎn)向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。 六、注意節(jié)約實驗材料、藥品和水、電等。 全書內(nèi)容共23個實驗，五年制本科、七年制醫(yī)學專業(yè)和研究生班教學根據(jù)具體情況選擇基本實驗，由學生自己動手操作，少數(shù)應用大型精密儀器的實驗進行參觀示教，另附實驗報告一冊。由于經(jīng)驗不足，水平有限，本教材一定還有很多缺點和錯誤，敬請使用者批評指正。九、有不遵守上述要求者，任課老師將終止其實驗，并取消其當堂實驗成績。 2．處死方法： 處死應以安樂死為原則，即使之無痛苦而迅速死亡。持法如圖。 不論細胞的形狀如何，細胞的結(jié)構一般分為三大部分：細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。顯微鏡下觀察可見肝細胞核染成蘭色，肝細胞緊密排列，擠成多角形(參照照片)。鏡臺測微尺是在一個載片中央封固的尺，長1毫米(1000μm)，被分為100格，每格長度是10微米。 染色后，將組織塊移到載片上，用鑷子將組織塊拉碎，就會有一些細胞或細胞群從組織塊脫離。 (時偉紅編)實驗三 液泡系(Vacuolar system)的活體染色及電鏡照片觀察【實驗目的】掌握一種活體染色方法，了解光學顯微鏡和電子顯微鏡下液泡系的基本形態(tài)結(jié)構。【實驗內(nèi)容】 一、成纖維細胞微絲的染色及其對細胞松馳素B的反應(一)原理微絲普遍存在于多種細胞，對細胞的形狀和運動有一定作用。 二、麗藻細胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細胞松弛素B的反應 (一)原理 麗藻細胞大，整個細胞的中央為大液泡占據(jù)。轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，細胞中央不著色的圓形區(qū)為細胞核。 (四)溶酶體(Lysosome) 小鼠肝細胞、人胃癌細胞溶酶體電鏡照片：溶酶體為一層單位膜包圍的囊狀結(jié)構。(時偉紅編)實驗六 細胞生理活動的實驗觀察【實驗目的】 通過制片與觀察加深理解細胞的運動、吞噬等生理活動。 二、暗視野觀察細胞的纖毛和鞭毛運動 (一)原理 暗視野照明法是一種不使照射被檢物體的光線直接進入物鏡的照明方法。圖6—2 蟾蜍口腔內(nèi)面圖 結(jié)果： 1．在低倍鏡下觀察上頜粘膜細胞纖毛運動的現(xiàn)象。 實驗步驟： 1．取一滴草履蟲培養(yǎng)液于載玻片上，放上幾根棉花纖維，以減慢草履蟲的運動。 4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。6. ％堿性固綠(～)中染色10～15分鐘,％酸性固綠(～)染色5～10分鐘。石蠟包埋，切片。 三、試劑 ／／L氯化鈣溶液、1％甲苯胺蘭染液、％詹納斯綠B染液、％NaCl溶液。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物， 0．25mol／／L氯化鈣溶液混勻成懸液(可用牙簽)。 馬蛔蟲受精卵細胞中只有6條染色體，而洋蔥體細胞的染色體為16條，因為它們都具有染色體數(shù)目少的特點，所以便于觀察和分析。 (二)蝗蟲精巢壓片標本的制備 l．采集 采集到各期分裂相的標本是實驗成功的關鍵，解決這一關鍵要把握兩點(1)時間：沈陽地區(qū)采集，一般在8月15至25日為宜；(2)蟲體特征：雄蟲翹膀長到剛好蓋住腹部一半時，正好是雄蟲精子發(fā)生的峰季，采集最適。(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，紡錘體形成，雙價染色體排列于赤道面，著絲點與紡錘絲相連。了解正常及腫瘤細胞核型的一般特征。 2． PHA溶液，封好備用。然后離心，棄上清，重復固定一次。加入少許低滲液將細胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。 第四確定F組：F組二對即第19～20號4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點。 (3)取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5ml Hanks液混勻，然后以1,000rpm離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細胞團塊彈散。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。棄去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培養(yǎng)基，同時用針頭的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。 (1)將上述l、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。2．你測定的細胞融合率為多少?(張之曾編)實驗十二 應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本【實驗目的】 通過細胞融合技術，初步了解染色體提前凝集標本制備原理、方法及間期細胞三種時相的提前凝集染色體特點。 細胞融合的誘導物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。 2．數(shù)目異常 由于腫瘤細胞分裂失去應有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一倍體數(shù)目異?，F(xiàn)象。 2．按時終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至10ml離心管中。各種因素的效應(如病毒、電離輻射、化學藥劑等)也可在淋巴細胞的培養(yǎng)條件下進行觀察，從而進行多種在體內(nèi)無法進行的研究。 (4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到兩極的染色體分別組成新核，新細胞的核具單倍數(shù)(n)的染色體組，胞質(zhì)再次分裂，這樣，通過減數(shù)分裂每個初級精母細胞就形成了四個精細胞。 (1)前期I(Prophase I)在減數(shù)分裂中，以前期I最有特征性、核的變化復雜，依染色體變化，又可分為下列各期：細線期(Leptotene stage)染色體呈細長的絲，稱為染色線。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細胞膜橫縊，兩個子細胞形成。 一、動物細胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片 (一)原理 無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因為此過程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami— tosis)。 3．剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3～5次，用3層紗布過濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標記，自然干燥。 12．加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。6．清水沖洗，室溫晾干。（二）方法1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。它是利用化學試劑與細胞內(nèi)的某些物質(zhì)進行化學反應，從而在細胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對組織內(nèi)的生物化學成分進行定性、定位、定量研究。 其體表，均勻密布纖毛，為運動細胞器。圖6—1中央遮光板a．光圈孔徑 b．濾光片直徑 (三)觀察蟾蜍上頜粘膜上皮細胞的纖毛運動 步驟： 1．用搗毀腦脊髓的方法處死蟾蜍。吞噬細胞首先由于趨化作用而向異物游走，然后伸出偽足包圍異物，并發(fā)生內(nèi)吞作用形成吞噬泡將異物吞入細胞，繼而溶酶體與吞噬泡融合消化異物。核中央海綿狀的一團深色結(jié)構是核仁。凸出的一側(cè)為形成面，可見許多小囊泡，凹入的一側(cè)為成熟面，可見扁平囊末端呈球形膨大，在分泌細胞中膨大部分不斷脫離扁平囊，形成分泌泡。 (三)結(jié)果 在麗藻內(nèi)質(zhì)中可以看到胞質(zhì)環(huán)流，用細胞松弛素B處理后，胞質(zhì)環(huán)流停止，洗去藥物，又出現(xiàn)胞質(zhì)環(huán)流。M一緩沖液有穩(wěn)定細胞骨架的作用。 大白鼠脛骺骨細胞電鏡照片，細胞核與核仁很清楚，細胞質(zhì)中有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，液泡系發(fā)達，液泡由單層膜包圍，細胞周邊有液泡釋放。脊的數(shù)量與細胞呼吸機能的強度有很大關系。細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。 6．人