【文章內(nèi)容簡介】 解為某碳源與氮源的重量之比，這是因為不同物質(zhì)，其含C或N的量不一致。 物理化學(xué)條件適宜：（1）PH：各類微生物都有其合適的生長PH范圍，如細菌PH在7—8，—, —, —, 對具體微生物來說,都有特定的最適PH。在微生物的生長繁殖過程中，由于代謝產(chǎn)物的生成，會改變原來的PH，因此會影響或殺死微生物，因此在配制培養(yǎng)基時應(yīng)考慮到培養(yǎng)基的PH調(diào)節(jié)能力，那么怎樣實現(xiàn)PH的自我調(diào)節(jié)呢？有兩種方法：（1）采用加入磷酸緩沖液的方式：—。如當兩者為等摩爾濃度比時，其原理如下：K2HPO4+HCI KH2PO4+KclKH2PO4+Kcl K2HPO4+H2O（2）采用加入CaCo3作“備用堿”的方式：CaCo3在水中的溶解度極低，加入培養(yǎng)基中，不會使PH升高，當微生物產(chǎn)酸時，就會被溶解，其原理如下：CO32 HCO31 H2CO3 CO2+H2O 透壓和Aw（水分活度）滲透壓過高或過低都不利于微生物的生長，過高造成質(zhì)壁分離，過低造成細胞吸水膨脹。等滲溶液最適宜微生物的生長。微生物在長期的進化過程中，形成了一套高度適應(yīng)滲透壓的特性，尤其是通過體內(nèi)大分子貯藏物的合成和分解方式來適應(yīng)。比滲透壓更有生理意義的是aw（Water Acticity）。其含義為：在同溫同壓下，某溶液的蒸汽壓P與純水蒸汽壓P0之比。也等于溶液的百分相對濕度（ERH） P ERHaw=—— = _____ P0 100—。 經(jīng)濟節(jié)約：主要是指在生產(chǎn)實踐中使用大量培養(yǎng)基時應(yīng)遵循的原則，如果下功夫，這方面的潛力是極大的，大致可從這樣幾個方面考慮：以粗代精，以野代家，以廢代好，以簡代繁，以烴代糧，以纖代糖，以國代進。（二） 四種方法： 生態(tài)模擬：在自然條件下，凡有微生物大量生長繁殖的地方，認為是具備微生物適應(yīng)生長的條件?？蓳?jù)此利用生態(tài)模擬的方法，配制一些初級、天然培養(yǎng)基，如：用肉湯、魚汁培養(yǎng)多種細菌；水果汁培養(yǎng)酵母；米糠培養(yǎng)霉菌，用米飯面包培養(yǎng)根霉；用肥土培養(yǎng)放線菌等。 查閱文獻：參閱文獻中的現(xiàn)有資料、數(shù)據(jù)等。 精心設(shè)計：借助優(yōu)選法或正交試驗工具。 試驗比較：小試中試生產(chǎn)。二、培養(yǎng)基的種類： 培養(yǎng)基名目繁多，種類各異，為了便于系統(tǒng)化，對其進行分類。（一） 按對培養(yǎng)基成分的了解程度分： 天然培養(yǎng)基：利用一些天然材料制成的培養(yǎng)基，對其成分無法確定。如用肉湯、 芽汁等制成的。 適合作實驗室用的基本培養(yǎng)基及大生產(chǎn)中的種子培養(yǎng)基。優(yōu)點：取材廣泛，營養(yǎng)豐富，種類多樣，配制方便。缺點：成分不穩(wěn)定，不清楚，因而無法作精細的定量分析。如：肉湯培養(yǎng)基等。組合培養(yǎng)基：（合成培養(yǎng)基、化學(xué)限定培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基）是用化學(xué)成分及其數(shù)量都很清楚的物質(zhì)配制的培養(yǎng)基。如：培養(yǎng)放線菌的高氏一號培養(yǎng)基等。優(yōu)點：成分精細，重演性高缺點：價格較貴，配制復(fù)雜用途：一般用作營養(yǎng)、代謝、生理、生化、遺傳、育種、菌種鑒定和生物測定等較高的研究工作。組合培養(yǎng)基：既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基稱。如土豆糖培養(yǎng)基，嚴格講凡是未經(jīng)嚴格處理的瓊脂的培養(yǎng)基都屬。（二） 按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基：外觀呈固態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)固體的性質(zhì)又可分為四種（1） 凝固培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入1—2%瓊脂或5—12%的明膠，可遇熱熔化、遇冷凝固，適合實驗室用。（2） 非可逆性凝固培養(yǎng)基：指由血清凝固或無機硅膠配制的凝固后不能再融化的培養(yǎng)基（3） 天然培養(yǎng)基：由天然基質(zhì)配制的培養(yǎng)基，如米糠、木屑、纖維、稻草粉等。（4） 濾膜：是一種醋酸纖維素薄膜，如果把它覆蓋在瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維素襯墊上，可將液體內(nèi)的微生物過濾下來。常用來計算水樣中的含菌量。用途：廣泛，可用于菌種的分離、鑒定、菌落計數(shù)等。可用于菌種保藏、生物活性物質(zhì)測定等。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入少量瓊脂（%左右），當培養(yǎng)基倒放時會流動，這種培養(yǎng)基稱用途：細菌運動觀察（穿刺接種）噬菌體的效價；厭氧菌的培養(yǎng)及菌種保藏。液體培養(yǎng)基：不加入凝固劑呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基即用途：廣泛，在實驗室中作各種生理、代謝研究和獲得大量菌體，生產(chǎn)上絕大多數(shù)用液體培養(yǎng)基。脫水培養(yǎng)基：（dehydrated culture media）又稱商品脫水培養(yǎng)基或預(yù)制干燥培養(yǎng)基，指含有除水以外的一切成分的商品培養(yǎng)基，用時只需加水和滅菌即可。（三） 按培養(yǎng)基的功能分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是培養(yǎng)細菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ承┗瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基叫。它的目的是使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該菌的篩選效率?；旌蠘悠分心撤N數(shù)量很少的微生物，用直接平板劃線或稀釋分離，難以秦效，這時根據(jù)該菌的“嗜好”，專門加入某種營養(yǎng)物，使它成為一種“加富培養(yǎng)基”而得到某菌種；另外一種辦法是在混合菌液中，加入能抑制優(yōu)勢菌生長的物質(zhì)，使其變成劣勢菌，而原來的劣勢菌相對變成優(yōu)勢菌，從而得到分離。加富培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。如加入血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。一般是用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求苛刻的微生物。一定意義上有選擇的作用。它可以增加所要分離微生物的數(shù)量，達到富集，從而形成優(yōu)勢，淘汰其它菌種。鑒別培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的變化，這樣可將該種微生物與其它微生物區(qū)分開來，這種培養(yǎng)基叫—第五節(jié) 微生物的純培養(yǎng)人類對微生物的應(yīng)用研究在大多數(shù)情況下是利用微生物的純培養(yǎng)物。在自然界中，微生物一般是群居的，因此需要我們把所需要的微生物從混雜的群體中將其分離出來。我們把只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物。這一過程稱為微生物的純培養(yǎng)。根據(jù)純培養(yǎng)過程中所用的技術(shù)不同，可大致分成如下幾類。一、 固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)：即利用微生物在固體培養(yǎng)基中生長可形成肉眼可見的菌落而進行培養(yǎng)。（重復(fù)解釋一下菌落的定義） 稀釋平板法：（pour plate method）無菌水稀釋樣品——取不同稀釋度的樣液與50。C的固體培養(yǎng)基混合——倒置培養(yǎng)——挑取菌落——重復(fù)——純種 平板劃線法（spread plate method）：以無菌接種環(huán)沾取少量樣品，在平板上劃線。 稀釋搖管法(dilution shake culture)： 此法是用固體培養(yǎng)基來培養(yǎng)嚴格厭氧的微生物。如果微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后放在封閉的容器中，采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于哪些對氧氣敏感的微生物，純培養(yǎng)分離可采用稀釋搖管法。它是稀釋平板法的一種變通形式。熔化固體培養(yǎng)基并冷卻到50。C左右——將待分離的材料用此培養(yǎng)基梯度稀釋（同稀釋平板法似）——迅速搖勻——凝固后在試管中倒一層固體石蠟和液體石蠟的混合無菌液——培養(yǎng)——在瓊脂柱中形成菌落——用無菌無氧的空氣將瓊脂柱吸出——用無菌刀將瓊脂柱切成段——觀察或移植。二、液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)：大多數(shù)細菌和真菌用平板法分離是完全可以的，因為它們能在固體培養(yǎng)基是很好的生長。但有一些微生物不能在固體培養(yǎng)基上生長，如細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等。通常采用的液體培養(yǎng)基分離純化法是稀釋法。原理是：接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，使一支試管中分配不到一個微生物，如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能是純培養(yǎng)物。采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（95%以上）表現(xiàn)為無微生物生長。三、單孢子分離法：此法是用顯微分離法從混雜的群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。主要用具是顯微鏡、解剖鏡或顯微操作儀等。一般在專業(yè)化較高的實驗進行。四、選擇培養(yǎng)基分離：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求，配制培養(yǎng)基，那么這種微生物能在此培養(yǎng)基上很好的生長，而其它微生物不能生長或生長受到抑制，這樣可將微生物分離出來。這種方法非常適合于含量低的微生物，如某一微生物在土壤中的含量僅為102—103則用平板稀釋法就難以分離。通常采用選擇培養(yǎng)基使之數(shù)量得到增加，再用平板稀釋法分離。常用如下兩種方式： 利用選擇培養(yǎng)基直接分離：主要是根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件。如在土壤中篩選蛋白酶產(chǎn)生菌，可有培養(yǎng)基中加牛奶或酪素，微生物生長時若產(chǎn)生蛋白酶，則會水解牛奶或酪素產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解圈，這樣可將大量非產(chǎn)蛋白酶的微生物淘汰。也可用高溫、抗生素等分離一些特定的微生物。 富集培養(yǎng)：原理：是利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，更容易分離出特定的微生物。富集的條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學(xué)、生物及綜合因素等多個方面進行選擇。如溫度、PH值、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等許多方面。如在土壤中分離能降解對羥基苯甲酸的微生物，可用下列方法。配制只含對羥基苯甲酸為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基——接種少量土樣——培養(yǎng)——取少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一新鮮的培養(yǎng)基——培養(yǎng)——如此重復(fù)多次，使該種微生物得到富集——再在平板上涂布，得菌落——挑取菌落分別培養(yǎng)在沒有該底物的培養(yǎng)基中和有該底物的培養(yǎng)基，在有底物的能生長，則為該種微生物。第五章 微生物的代謝教學(xué)目的和要求：通過本章的學(xué)習(xí)使學(xué)生掌握微生物的合成代謝和分解代謝的方式及發(fā)酵、呼吸等的概念。重點和難點：重點是微生物合成代謝和分解代謝的方式及發(fā)酵和呼吸的概念；難點是微生物代謝的方式和途徑。第一節(jié) 微生物的能量代謝 大家都知道，生物的一切活動都是耗能的，因此，能量代謝就成了新陳代謝中的核心，能量代謝的中心任務(wù)是把外界環(huán)境中多種形式的最初能源轉(zhuǎn)換成生物的通用能源ATP。對微生物來講，它們可利用的最初能源不外乎三種，即有機物、日光、及還原態(tài)無機物。因此研究能量代謝的機制實際上是追蹤這三類能源如何一步步轉(zhuǎn)化并釋放出ATP。一、 異養(yǎng)微生物的生物氧化和產(chǎn)能生物氧化就是發(fā)生在活細胞內(nèi)的一系列產(chǎn)能氧化反應(yīng)的總稱。生物氧化與非生物氧化即燃燒有著若干相同點和不同點。 （一）底物脫氫：主要有四條途徑：EMP、HMP、ED途徑和三羧酸循環(huán)（1）EMP途徑（EmbdemMeyerhofPatnas Pathway）： EMP途徑又稱糖酵解途徑或已糖二磷酸途徑，它是經(jīng)10步反應(yīng)而產(chǎn)生2分子丙酮酸和2分子ATP的過程， EMP途徑是絕大多數(shù)生物所共有的基本代謝途徑。由以上途徑可知，在無氧條件下整個EMP途徑的產(chǎn)能效率是很低的，每個葡萄糖分解產(chǎn)生2個ATP，但其中產(chǎn)生的多種中間代謝物不僅可為合成反應(yīng)提供原材料，而且起著連接許多有關(guān)代謝途徑的作用。從微生物發(fā)酵生產(chǎn)的角度來看，EMP途徑與乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇和丁二醇等大量重要發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)有密切關(guān)系。（2）HMP途徑：（Hexose Monophos Phatp Patgway）： 即已糖磷酸途徑，又稱戊糖磷酸途徑，Warburg—Dickens途徑，或磷酸葡萄糖酸途徑。 該途徑是一條葡萄糖不經(jīng)EMP和TCA途徑而得到徹底氧化，并產(chǎn)生大量的能量。一般認為HMP途徑不是產(chǎn)能途徑，而是為生物合成提供大量還原力（NADPH）和中間代謝產(chǎn)物。HMP途徑在微生物的生命活動中有重要意義：（1） 為核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖—磷酸（核酮糖5磷酸是合成核酸、某些輔酶和組氨酸的原料）（2） 產(chǎn)生大量的NADPH2還原劑，它不僅為合成脂肪酸、固醇等重要細胞物質(zhì)所需要，而且可以通過呼吸鏈產(chǎn)生大量能量，（但這不是代謝中的主要方式，不能把HMP途徑看作是產(chǎn)生ATP的有效途徑）這些都是EMP和TCA過程無法完成的，因此凡存在HMP途徑的微生物，當它們處在有氧條件下時就不必再依賴TCA循環(huán)獲得所需的NADH2。（3）EDP途徑（EnterDoudoroff Pathway） 又稱2酮脫氧6磷酸葡萄糖酸裂解途徑。（KDPG） ED途徑是在研究嗜糖假單胞菌時發(fā)現(xiàn)的，是少數(shù)缺乏完整EMP途徑的微生物所具有的一種替代途徑，如在革蘭氏陰性菌中分布較廣，特別是假單胞菌和固氮菌的某些菌株較多存在，在其它生物中還未發(fā)現(xiàn)。其特點是葡萄糖只經(jīng)4步反應(yīng)即可獲得EMP途徑須經(jīng)10步才能獲得的丙酮酸。進入三羧酸循環(huán)。（4）三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycly）又稱TCA循環(huán)，Krebs循環(huán)或檸檬酸循環(huán)。該循環(huán)在絕大多數(shù)異養(yǎng)微生物的氧化性（呼吸）代謝中起著關(guān)鍵性的作用。從微生物的物質(zhì)代謝中可以看出TCA循環(huán)是處于樞紐的地位，工業(yè)中生產(chǎn)的檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸和谷氨酸等，都可在這個循環(huán)中看到。遞氫和受氫：在生物體中，貯存在葡萄糖等有機物中的化學(xué)能，經(jīng)上述的多種途徑脫氫后，經(jīng)呼吸鏈（或稱電子傳遞鏈）等方式進行遞氫，最終與受氫體CO無機物結(jié)合，以釋放其化學(xué)潛能，根據(jù)遞氫特別是受氫過程中氫受體性質(zhì)不，可把生物氧化區(qū)分成呼吸（有氧呼吸）、無氧呼吸和發(fā)酵三種類型。 呼吸（Respiration）呼吸鏈是指位于原核細胞膜上或真核細胞線粒體膜上的，由一系列氧化還原勢不同的氫傳遞體（或電子傳遞體）組成的一組鏈狀傳遞順序，它能把H或電子從低氧化還原勢的化合物傳遞給高氧化還原勢的分子氧或其它無機、有機氧化物，并使它們還原。在H或電子傳遞過程中，通過與氧化磷酸化反應(yīng)發(fā)生偶聯(lián)，就可產(chǎn)生ATP形式的能量。在微生物中，最重要的呼吸鏈組分有以下幾種：（1） 煙酰胺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）：（2） 黃素腺嘌呤二核苷酸