【文章內(nèi)容簡介】 NA序列測定。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。㈡ 核酸探針的標(biāo)記方法⒈缺口平移法 大腸桿菌DNA聚合酶I具有5′174。3′DNA聚合酶活性，以相對(duì)應(yīng)的鏈為模板，從切口處3′OH端逐個(gè)加入新的核苷酸，此酶還具有5′174。3′外切核酸酶活性，可從切口的5′端逐個(gè)切去核苷酸，造成切口平移。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如[a32P] dNTP，則隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。缺口平移法適用于標(biāo)記大于1 kb的雙鏈DNA。⒉隨機(jī)引物法： 隨機(jī)引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機(jī)引物，沿單鏈模板進(jìn)行DNA的合成。⒊末端標(biāo)記只將DNA 3′端或5′端標(biāo)記的方法稱末端標(biāo)記，常用的方法如下：(1)DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法(圖73)。用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平切口或粘性末端。(2) T4DNA聚合酶標(biāo)記法。加入dNTP后抑制外切活性可將標(biāo)記的dNTP進(jìn)行填充標(biāo)記。(3)T4多核苷酸激酶標(biāo)記法。用該酶可將g32P從[g32P] ATP轉(zhuǎn)移至核酸的5′OH端(4)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法。將多種標(biāo)記的dNTP逐個(gè)轉(zhuǎn)移到核酸缺口中的3′OH端，形成長尾標(biāo)記。二、非放射性標(biāo)記核酸探針：㈠ 生物素標(biāo)記：生物素能以共價(jià)結(jié)合方式連接到UTP或dUTP的嘧啶環(huán)C5位置上，形成生物素化的核苷酸。其標(biāo)記方法有摻入標(biāo)記法和光敏生物素標(biāo)記方法。1. 摻入標(biāo)記法：生物素標(biāo)記的dNTP可代替相應(yīng)的單核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通過隨機(jī)引物法或缺口平移法，將生物素化核苷酸摻入到DNA分子中，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。2.光敏生物素標(biāo)記法：先通過連接臂將一個(gè)光敏基團(tuán)連接于生物素，成為光敏生物素(photobiotin) ㈡ 半抗原地高辛配基標(biāo)記方法：將Dig與dUTP(或dCTP，dCTP)相連生成DigdUTP復(fù)合物，再通過切口平移法和隨機(jī)引物法將其摻入到DNA上。3 核酸分子雜交在基因診斷中的應(yīng)用？舉例說明。 答：核酸雜交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過程。常用的技術(shù)有Southern印跡、Northern印跡、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等。通過核酸雜交技術(shù)，可以利用帶有某種標(biāo)記的已知核酸片段作為探針，去檢測未知核酸序列。因此，核酸雜交可用于基因鑒定和基因突變分析等領(lǐng)域限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 ：多態(tài)性（polymorphism）指基因組中特定基因座位（DNA序列）存在兩種或兩種以上狀態(tài)（等位基因），并且其中任何一個(gè)等位基因在人群中的頻率不低于1%。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或消除原有的酶切位點(diǎn)）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時(shí)產(chǎn)生不同長度的片段?？山柚鷖outhern blotting或PCR 的方法進(jìn)行檢測RFLP分析與遺傳病基因診斷。人類染色體VNTR序列的RFLP分析圖譜：DNA fingerprinting。等位基因特異性寡核苷酸（ASO）探針雜交寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，因此可用人工合成的針對(duì)正常和突變等位基因的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，檢測點(diǎn)突變。基因表達(dá)分析 常用Northern blotting或原位雜交分析。第九章名詞解釋：1 基因組文庫：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細(xì)胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細(xì)胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱基因組文庫。：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補(bǔ)DNA（cDNA ）建立基因文庫（gene library）。問答1 目的基因克隆時(shí)常用哪些方法分離和獲得基因？答：一 、化學(xué)合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其對(duì)應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列。第一個(gè)核苷酸固定于不溶性的固相載體上, 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開始，以3’、5’磷酸二酯鍵與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團(tuán) ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物, 再用同樣的步驟與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng), 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來, 解除保護(hù)基, 進(jìn)一步純化。二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法擴(kuò)增目的基因：以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板, 利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種dNTP由引物沿模板從5’→3’按堿基配對(duì)原則, 形成與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈, 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)2530個(gè)循環(huán)產(chǎn)物呈 2n指數(shù)擴(kuò)增，由pg—μg（紫外可見），可獲得基因片段三、建立基因組DNA文庫：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細(xì)胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細(xì)胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱基因組文庫。四、構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補(bǔ)DNA（cDNA ）建立基因文庫（gene library）五、其他方法㈠ 構(gòu)建差示文庫篩選特殊基因差示文庫；㈡ mRNA差異顯示法獲得目的基因 ；㈢ 基因改造可獲得新型目的基因？答：意義：提供全套遺傳信息, 即完整的基因組DNA,可以研究基因組中5’端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列, 內(nèi)含子的分布和作用, 以及重復(fù)序列的數(shù)量分布及大小 過程：⑴ 分離純化基因組DNA,提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA； ⑵制備全部基因組的DNA片斷。①機(jī)械斷裂法:用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端，因此插入載體之前還需要進(jìn)行修飾加工，少用②限制性內(nèi)切酶降解（鳥槍法）過去用EcoRⅠ,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過的載體連接。 ⑶DNA片斷與載體的連接包裝 常用載體：粘性質(zhì)粒 λ噬菌體 酵母人工染色體①基因組DNA +粘性質(zhì)?！亟MDNA——轉(zhuǎn)化細(xì)菌——菌落 ②基因組DNA +λ噬菌體——重組DNA—包裝成噬菌體——感染細(xì)菌——噬菌斑1個(gè)克隆含有基因組的某個(gè)片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。3 構(gòu)建cDNA文庫的意義？常用載體及構(gòu)建過程如何？答：意義：通過構(gòu)建cDNA文庫能直接分離到生命活動(dòng)過程中的一些調(diào)控基因及了解這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系．因此cDNA文庫的構(gòu)建是基因克隆的重要方法之一，從cDNA文庫中可以篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。它是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的工具。常用載體是質(zhì)粒（λ噬菌體）。過程： 1)取材：mRNA約占總RNA的1－5％，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島β細(xì)胞為原始生物材料，細(xì)胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為材料；2)從總的RNA中分離mRNA：將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸[ oligo(dT) ] 纖維素中進(jìn)行親和層析 cDNA合成 1）以O(shè)ligo(dT) 為引物：從模板3’末端開始，沿模板的3’→5’方向合成, 對(duì)于較長的mRNA分子很難得到全長cDNA ；2）隨機(jī)引物：以6～8個(gè)核苷酸為隨機(jī)引物，從mRNA的不同結(jié)合點(diǎn)合成全長cDNA第一鏈（RNADNA）⑴ 自身引導(dǎo)法；⑵ 置換合成法；⑶ 外加引物合成法 4 采用單酶切點(diǎn)法克隆基因時(shí)有什么缺點(diǎn)？如何克服？答：（1）高背景：載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后，載體分子易于自我環(huán)化，既不利于目的基因的重組連接，大大降低陽性克隆效率，又可使非重組性載體造成高背景。應(yīng)對(duì)方法：通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5p以抑制DNA的自我環(huán)化。（2）雙向插入：經(jīng)單一限制核算內(nèi)切酶切割的目的基因和載體，因兩者的粘性末端是相同的，因此在連接反應(yīng)中，目的基因可發(fā)生雙向插入。載體對(duì)目的基因的表達(dá)是有方向的，而目的基因可雙向與之連接，這種連接如以克隆目的基因片段為目的則沒有影響，若以表達(dá)為目的，就要對(duì)插入的片段進(jìn)行方向鑒定。應(yīng)對(duì)方法：若構(gòu)建表達(dá)DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以使定向克隆。5 目的基因與載體的連接方法有哪些？基因重組時(shí)在倆個(gè)酶切位點(diǎn)中其中有一個(gè)不相匹配時(shí)，你如何解決連接問題？答：連接方法：㈠ 粘性末端的連接：1．單酶切點(diǎn)的粘性末端：目的基因片段與載體由相同的單一限制性內(nèi)切酶消化酶切后，兩者的末端均具有相同的粘性末端，然后兩者相互連接。 ，是用兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶切割目的基因，使之產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端，載體也用相同的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將載體切開，此時(shí)載體不僅不會(huì)發(fā)生自我環(huán)化，而且只能在DNA連接酶的作用下與目的基因的相應(yīng)的粘性末端互補(bǔ)連接㈡ 平端連接法：；；（帶有相應(yīng)酶切點(diǎn)的粘性末端）；－A克隆法 TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因DNA的同時(shí), 能不依賴模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩3’端加上兩個(gè)游離的“A”。 6 試述TA克隆法的原理和用途。答：TA克隆法是一種對(duì)PCR產(chǎn)物直接克隆的技術(shù)。TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因DNA的同時(shí), 能不依賴模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩3’端加個(gè)游離的“A”。這樣只要載體切口處人工加上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。這種技術(shù)使得PCR產(chǎn)物的克隆變得非常簡單。第十章1 轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（或細(xì)菌）的過程稱轉(zhuǎn)染。2 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。3 轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞。使原來細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化，常見的轉(zhuǎn)化方法有：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法4 α互補(bǔ)：原理：所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無β半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過α肽