【正文】 制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些；b、擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋?zhuān)籧、延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。8 DNA連接酶(Ligase）:是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′OH和5′P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補(bǔ)粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA,被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。常用于使酶切位點(diǎn)中的堿基甲基化而避免降解，保護(hù)酶切位點(diǎn)。2 同尾酶：有一些限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序不完全恒定，即識(shí)別順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣黏性末端的兩種酶稱(chēng)為同尾酶，如BamHⅠ和Bgl Ⅱ。六，真核生物具有對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接能力。二，真核生物DNA都有內(nèi)含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。特點(diǎn)：一，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：對(duì)細(xì)胞的感染效率高，并能表達(dá)整合的病毒基因；可以同時(shí)感染大量細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)間感染細(xì)胞并不會(huì)發(fā)生毒害作用；宿主范圍十分廣泛；可以進(jìn)行DNA的單拷貝整合；但穩(wěn)定性差，安全性差，重組病毒滴度不高而且局限于感染分裂細(xì)胞。三：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)DNA的結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象上細(xì)微的改變，從而發(fā)揮調(diào)控作用。問(wèn)答1 真核表達(dá)調(diào)控的順式作用元件有哪些？其作用特點(diǎn)是什么？ 答：順式作用元件有：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子，衰減子，終止子。第四章名詞解釋?zhuān)? 鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)組氨酸殘基通過(guò)位于中心的鋅離子結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。5 終止密碼子：有三個(gè)密碼子（UAA, UAG，UGA），為終止密碼子，只表示鏈的終止，不表達(dá)氨基酸。3 終止子：位于一個(gè)基因編碼區(qū)下游提供終止信號(hào)的DNA序列，可以被RNA聚合酶識(shí)別并發(fā)出停止mRNA合成的信號(hào)。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測(cè)序（合成儀、測(cè)序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴(kuò)增儀）。轉(zhuǎn)位作用：轉(zhuǎn)位子具有雙向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位點(diǎn)上的移動(dòng)方式。具隨機(jī)整和能力，可用作病毒載體問(wèn)答：1 什么叫做基因？何謂基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。6 衛(wèi)星DNA：又稱(chēng)隨體DNA,不編碼蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄RNA的小片段高度重復(fù)一類(lèi)小片段DNA序列，多富含GC堿基在DNA浮力密度實(shí)驗(yàn)中會(huì)在主峰旁形成些小峰，形似衛(wèi)星分布而稱(chēng)之。將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱(chēng)為斷裂基因3 RNA剪接：將斷裂基因的內(nèi)含子刪除和表達(dá)子連接并最終形成成熟mRNA的過(guò)程。起始階段Dicer酶以依賴(lài)ATP的方式切割外源性的雙鏈RNA為小分子干擾RNA，清除病毒，阻斷轉(zhuǎn)座子表達(dá)；效應(yīng)階段小分子干擾RNA結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)活化的復(fù)合物及RISC，然后RISC結(jié)合至mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割它，從而發(fā)揮作用。主要催化RNA的剪接反應(yīng)和剪切反應(yīng)。：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源RNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。與RNA酶有顯著區(qū)別，它是RNA，后者是蛋白質(zhì)。：小核RNA，只存在于細(xì)胞核或者核質(zhì)核仁中的一類(lèi)小分子量的RNA，具有獨(dú)特功能并且獨(dú)立存在的實(shí)體，約為70300個(gè)核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。，是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，即堿基序列正好與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA分子。？其功能和醫(yī)學(xué)意義如何？答：又稱(chēng)為調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，也即堿基序列與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA分子。應(yīng)用意義：通過(guò)設(shè)計(jì)合成特異性切割病毒以及病毒的RNA的核酶，對(duì)病毒和腫瘤的基因治療將發(fā)揮重要作用。應(yīng)用前景：大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的應(yīng)用；用于基因治療；基因表達(dá)的調(diào)控。4 重疊基因：不同基因的核苷酸序列有時(shí)為相鄰兩個(gè)基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個(gè)基因稱(chēng)為重疊基因。一般510bp短序列，人類(lèi)為171bp，保護(hù)和穩(wěn)定染色體7 基因組：表示某物種單倍體的總DNA。所謂基因的新概念是隨著近年分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，提出的移動(dòng)基因，斷裂基因，重疊基因，假基因等基因的新概念。后果：可以在細(xì)菌染色體或質(zhì)粒中隨機(jī)轉(zhuǎn)移，被插入的基因即失去活性。第三章名詞解釋?zhuān)?基因表達(dá)：是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA, 再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。4 起始密碼子：編碼多肽鏈的第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。問(wèn)答1外源基因在大腸桿菌中表達(dá)需要的條件有哪些？答：條件：一：外源基因插入序列必須保持有正確的方向和閱讀框架。 2 亮氨酸拉鏈：存在與蛋白C末端，—螺旋形成的對(duì)稱(chēng)二聚體，約為30個(gè)氨基酸，每?jī)蓚€(gè)亮氨酸之間隔有六個(gè)氨基酸，于是每?jī)扇β菪陀幸粋€(gè)亮氨酸，排成一排，從而在2個(gè)α螺旋的蛋白分子之間形成一條拉鏈。作用特點(diǎn)：是能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。四：反式作用元件在合成過(guò)程中有相當(dāng)大的可變性和可塑性。二，痘類(lèi)病毒載體：對(duì)多種細(xì)胞敏感易于培養(yǎng)利于大量生產(chǎn)制備；對(duì)外環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定并易于保存運(yùn)輸；接種途徑簡(jiǎn)單易行；利于多價(jià)疫苗的研究開(kāi)發(fā)；利于大片段的外源性基因的插入，且不影響病毒的正常復(fù)制和表達(dá)，但是基因組分子量大不易操作，沒(méi)有mRNA的剪切功能故不宜采用基因組DNA，需使用無(wú)內(nèi)含子的cDNA。三，真核生物可以在需要時(shí)可以重排某些DNA片段和擴(kuò)增特定基因的機(jī)制，而原核生物沒(méi)有。七，真核生物不存在操縱子結(jié)構(gòu)，原核生物多是。 3 同裂酶：識(shí)別序列相同，對(duì)甲基化切點(diǎn)敏感性不同的兩種酶 。5 Klenow酶：為DNA聚合酶Ⅰ大片段，是經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶Ⅰ，切除小亞基，保留的大亞基部分。問(wèn)答：1 影響Ⅱ型核算內(nèi)切酶活性的因素有哪些？如何克服？答：一、DNA的純度。二、DNA的甲基化程度。不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。四、DNA分子結(jié)構(gòu)。同時(shí)還有其他一些如巰基試劑、適宜PH值、甘油體積分?jǐn)?shù)等對(duì)不同的內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)要求也不同2 如何實(shí)現(xiàn)DNA粘性末端連接?單酶切點(diǎn)的連接如何降低本底和克服自我環(huán)化？答：用同一限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)載體及外源DNA作相同消化，隨后把這兩種DNA混合起來(lái)，加入DNA連接酶，便可產(chǎn)生出穩(wěn)定的雜種DNA。 3 基因片段與載體間的平末端連接有什么方法？答：連接平末端DNA分子的方法有兩種：一、T4連接酶連接法。為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶有3/OH的單鏈延伸，需要用5/特異的核酸外切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個(gè)末端核苷酸。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點(diǎn)。這樣低濃度的mRNA被擴(kuò)增放大易于檢測(cè)。4原位PCR：直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。6 Northern印跡：將RNA樣品變性和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。9 Western印跡:一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，將蛋白質(zhì)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固體載體上，然后加入抗體形成抗原抗體復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將 結(jié)果顯示到膜或底片上。即個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。三，致病病毒的檢測(cè)：檢測(cè)HIV，HBV,HSV單純皰疹病毒,HPV人乳頭病毒,等。HCV是單股正鏈RNA病毒，可采用逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合巢式PCR法對(duì)急性丙型肝炎作出快速診斷四，腫瘤的診斷和研究如抑癌基因，癌基因的檢測(cè)，腫瘤相關(guān)病毒基因的研究等。比如在針對(duì)支原體，螺旋體，衣原體，幽門(mén)螺旋桿菌等不易生長(zhǎng)的細(xì)菌檢測(cè)。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如[a32P] dNTP，則隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平切口或粘性末端。(3)將多種標(biāo)記的dNTP逐個(gè)轉(zhuǎn)移到核酸缺口中的3′OH端，形成長(zhǎng)尾標(biāo)記。2. 答：核酸雜交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或消除原有的酶切位點(diǎn)）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段?；虮磉_(dá)分析 常用Northern blotting或原位雜交分析。第一個(gè)核苷酸固定于不溶性的固相載體上, 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開(kāi)始，以3’、5’磷酸二酯鍵與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團(tuán) ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物, 再用同樣的步驟與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng), 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來(lái), 解除保護(hù)基, 進(jìn)一步純化。①機(jī)械斷裂法:用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒(méi)有與克隆載體匹配的粘末端，因此插入載體之前還需要進(jìn)行修飾加工，少用②限制性?xún)?nèi)切酶降解（鳥(niǎo)槍法）過(guò)去用EcoRⅠ,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過(guò)的載體連接。常用載體是質(zhì)粒（λ噬菌體）。載體對(duì)目的基因的表達(dá)是有方向的，而目的基因可雙向與之連接，這種連接如以克隆目的基因片段為目的則沒(méi)有影響，若以表達(dá)為目的，就要對(duì)插入的片段進(jìn)行方向鑒定。 6 試述TA克隆法的原理和用途。這種技術(shù)使得PCR產(chǎn)物的克隆變得非常簡(jiǎn)單。使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)化方法有：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法4 α互補(bǔ)：原理：所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無(wú)β半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過(guò)α肽互補(bǔ)作用可呈現(xiàn)有功能的β半乳糖苷酶活性, 進(jìn)而可分解底物Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍(lán)色的底物5溴4氯