【文章內(nèi)容簡介】 ） 2022/4/14 ? 但也有相反的情況 如苯氨萘磺酸類化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五種醇中隨著醇的極性增大，熒光強(qiáng)度減小，熒光峰藍(lán)移 2022/4/14 ? 如果溶劑和熒光物質(zhì)形成了化合物或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)或存在型體改變 ， 則熒光峰位置和強(qiáng)度都會發(fā)生較大的改變 ? 如果溶液分子與熒光物質(zhì)形成氫鍵 ， 將使熒光峰明顯紅移 ， 熒光強(qiáng)度一般增大 2022/4/14 ? 在含有重原子的溶劑（如溴化正丙酯等）中，一般也使熒光體的熒光強(qiáng)度降低，而使磷光強(qiáng)度升高，這種現(xiàn)象稱為“ 外重原子效應(yīng) ” ? 溶劑中重原子的高核電荷引起溶質(zhì)分子的自旋與軌道之間強(qiáng)烈的偶合作用，結(jié)果使 S1→T 1 的系間的跨躍、磷光發(fā)射及 T1→ S 0的系間跨躍等過程的幾率增大。因此熒光削弱，而磷光增強(qiáng) 2022/4/14 5. 溫度對熒光強(qiáng)度的影響 ? 溫度對熒光強(qiáng)度的影響較敏感 。 溫度上升 ， 熒光強(qiáng)度下降 (這是因為分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用和溶液溫度上升時介質(zhì)的粘度降低 ， 熒光物質(zhì)與溶劑分子的碰撞也隨之增加 ) ? 熒光分析時一定要控制好溫度 ? 低溫?zé)晒饪梢蕴岣哽`敏度 ， 已發(fā)展為熒光分析中的一個重要分支 2022/4/14 不同溫度下鄰菲羅 啉的熒光光譜 2022/4/14 ? 溶液不存在猝滅劑時，熒光的量子產(chǎn)率與去激化的輻射躍遷過程及非輻射躍遷過程的相對速率有關(guān) ? 一般認(rèn)為輻射過程速度不隨溫度變化，因此，熒光量子產(chǎn)率的變化反映了非輻射躍遷過程速率的變化 2022/4/14 ? 隨著溶液溫度的升高，介質(zhì)粘度降低，分子運(yùn)動速度也變大，從而使熒光分子與溶劑分子或其它分子的碰撞機(jī)率增加，外部能量轉(zhuǎn)移速率變化。因此，熒光產(chǎn)率降低 ? 溶液溫度上升而使熒光強(qiáng)度降低的另一個主要原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用 2022/4/14 多原子分子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的位能曲線可能相交或相切于一點。 當(dāng)激發(fā)態(tài)分子接受到額外熱能而沿激發(fā)位能曲線AC移動至交點 C時，有可能轉(zhuǎn)換至基態(tài)的位能曲線 NC， 使激發(fā)轉(zhuǎn)化為基態(tài)的振動能，隨后通過振動弛豫而喪失振動能量 2022/4/14 6. 溶液 pH值對熒光強(qiáng)度的影響 ? 帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的 pH有關(guān) ? 金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光螯合物也受到溶液 pH值的影響。 pH既影響螯合物的形成，又影響螯合物的組成，因而影響它們的熒光性質(zhì) 2022/4/14 ? 在不同酸度介質(zhì)條件下，熒光體的存在型體不同，不同的型體 (分子與其離子 )在電子構(gòu)型上有所不同，而且基態(tài)和激發(fā)態(tài)所表現(xiàn)出來的酸堿性也有所差別。因此不同酸度下，熒光光譜和熒光強(qiáng)度都可能發(fā)生變化 ? 在熒光分析中一般都要較嚴(yán)格地控制溶液的 pH值 2022/4/14 2022/4/14 7． 形成氫鍵的影響 ? 熒光物質(zhì)與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子所形成的分子間氫鍵可能有兩種情況 ? 一種是在激發(fā)之前熒光體的基態(tài)所形成的氫鍵，這種情況一般使摩爾吸光系數(shù)增大，即吸收增強(qiáng)，因此熒光強(qiáng)度增大，同時也可能發(fā)生分子極性及共軛程度的變化。因此吸收光譜 (熒光激發(fā)光譜 )及熒光發(fā)射光譜都可能發(fā)生變化 ? 另一種情況是激發(fā)之后熒光體的激發(fā)態(tài)所形成的氫鍵，所以吸收光譜 (激發(fā)光譜 )不受影響，而熒光發(fā)射光譜會發(fā)生變化 2022/4/14 8．有序介質(zhì) 的影響 表面活性劑 ? 熒光體熒光體在由表面活性劑形成膠束的微環(huán)境中，可以減少非輻射去激化過程和猝滅過程的速度，提高熒光量子產(chǎn)率 ? 由于表面活性劑參與組成更高次配合物（多元配合物）而增大配合物分子的有效吸光截面積，導(dǎo)致摩爾吸光系數(shù)的增大，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 在膠束溶液中，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，測定的靈敏度提高 2022/4/14 表面活性劑（ 兩親分子 ） 能使水的表面張力明顯降低的溶質(zhì)稱為表面活性物質(zhì) 這種物質(zhì)通常含有 親水的極性基團(tuán) 和 憎水的非極性碳鏈或碳環(huán) 有機(jī)化合物。親水基團(tuán)進(jìn)入水中，憎水基團(tuán)企圖離開水而指向空氣，在界面定向排列 表面活性劑在水中隨著濃度增大，表面上聚集的活性劑分子形成定向排列的緊密單分子層，多余的分子在體相內(nèi)部也三三兩兩的以憎水基互相靠攏，聚集在一起形成膠束，這開始形成膠束的最低濃度稱為 臨界膠束濃度 critical micelle concentration 2022/4/14 臨界膠束濃度 (critical micelle concentration) 2022/4/14 膠束 (micelle) 2022/4/14 超分子化合物（環(huán)糊精） ? 一般有空腔，與熒光體形成主客體包合物 ? 降低熒光體活動自由度 ? 對熒光體起屏蔽作用 熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 2022/4/14 2022/4/14 2022/4/14 9． 熒光的猝滅 ? 從廣義上說 ， 指的是任何可使某給定熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低的作用 ， 或者任何可使熒光強(qiáng)度不與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的作用 ? 從狹義上說，熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象 ? 這些引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑 2022/4/14 熒光的猝滅的主要類型有： （ 1）碰撞猝滅 ? 碰撞猝滅是熒光猝滅的主要原因 2022/4/14 相對速率 ? M + hν M* (激發(fā) ) 1 ? M* k1 M + hν’(發(fā)生熒光 ) kf[M*] ? M* + Q k2 M + Q + 熱 (猝滅 ) KQ[M*][Q] M*為單重激發(fā)態(tài)熒光分子； Q 為猝滅劑； kf， kQ為相應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù) 熒光猝滅程度與 kf， kQ的相對大小和猝滅劑濃度有關(guān) ? 溶液粘度增大，碰撞猝滅減小 ? 溫度增加，碰撞猝滅增加 2022/4/14 減少碰撞去激發(fā)的途徑 ? 降低溫度 ? 增大溶液粘度 ? 把熒光 (磷光 )物質(zhì)附著在固體上，支撐物測定 2022/4/14 ? 特別要指出的是磷光發(fā)射，因其平均壽命較長，碰撞去激發(fā)的效應(yīng)更大，所以常采用低溫磷光或固體磷光方法 2022/4/14 （ 2） 生成化合物的猝滅（ 靜態(tài)猝滅） ? 指的是基態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑反應(yīng)生成非熒光的化合物，導(dǎo)致熒光的猝滅 2022/4/14 ? 從上式也容易推導(dǎo)出熒光強(qiáng)度與猝滅劑平衡濃度之間的關(guān)系 ? 式中 (If)0及 (If)q分別為加入猝滅劑 Q之前及之后的熒光強(qiáng)度， CM為熒光物質(zhì)的總濃度 ? 上面的關(guān)系式可以用于熒光猝滅法的定量分析 2022/4/14 （ 3） 能量轉(zhuǎn)移 （ 動態(tài)猝滅 ） ? 產(chǎn)生于猝滅劑與處于激發(fā)單重態(tài)的熒光體作用后 ， 發(fā)生能量轉(zhuǎn)移 ， 使猝滅劑得到激發(fā) ， 其反應(yīng)如下： ? M* + Q M + Q* (猝滅 ) ? 俗稱 “ 內(nèi)濾作用 ” 2022/4/14 （ 4） 氧的猝滅作用 ? O2可以說是熒光和磷光的最普遍存在的猝滅劑。對于溶液磷光來說，氧的猝滅作用是十分有效的，通常觀察不到溶液的室溫磷光現(xiàn)象。而對于溶液熒光來說，不同的熒光物質(zhì)和同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，對氧的猝滅作用的敏感性有所不同 ? 這可能是由于順磁性的氧分子與處于單重激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)分子相作用，促進(jìn)形成順磁性的三重態(tài)熒光分子，即加速系間竄躍所致 2022/4/14 （ 5） 自猝滅和自吸收 ? 當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時 ， 常會發(fā)生自猝滅現(xiàn)象 ， 使熒光強(qiáng)度降低 。 這可能是由于激發(fā)態(tài)之間的相互碰撞引起能量損失 ? 當(dāng)熒光物質(zhì)的熒光光譜曲線與吸收光譜曲線重疊時 ， 熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收 ， 稱為自吸收 2022/4/14 （ 四 ） 熒光強(qiáng)度 ? 發(fā)射的熒光光強(qiáng) IF應(yīng)正比于該系統(tǒng)吸收的激發(fā)光的光強(qiáng) ， IF=K’（ I0I） （ 8— 1） ? 式中 I0是入射光強(qiáng)度 ， I是通過厚度為 b的介質(zhì)后的光強(qiáng) ， 常數(shù) K’取決于熒光效率 2022/4/14 ? 根據(jù)比耳定律： I/ I0=10εbc (8— 2) ? 式中 ε是熒光分子的摩爾吸光系數(shù) ， b是液槽厚度 ， c是熒光物質(zhì)的濃度 2022/4/14 ? 將 （ 82） 式代入 （ 81） 式 ， 即可得到： IF=K’I0（ 1 10εbc） （ 8— 3） ? 展開 （ 8— 3） 且當(dāng) I0一定時可得： IF=Kc （ 8— 4） 2022/4/14 ? 由此可見 ， 在低濃度 （ εbc≤） 時 ，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系 ? 當(dāng)高濃度時，由于自熄滅和自吸收等原因 ，使熒光強(qiáng)度與分子濃度不呈線性關(guān)系，隨著液槽厚度的增加，彎曲情況發(fā)生在更低的濃度處 2022/4/14 二、熒光分析儀器 ? 熒光分析使用的儀器可分為目視 、 光電 、分光三種類型 ? 它們通常均由光源 、 用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長的單色器 （ 濾光片或光柵 ） 、 液槽及檢測器組成 ? 為了消除入射光及散射光的影響 ， 熒光的測量應(yīng)在與激發(fā)光成直角方向上進(jìn)行 2022/4/14 熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖 光源 氙燈 激發(fā)單色器 樣品池 光電倍增管 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 光源 樣品池 激發(fā) 單色器 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 發(fā)射 單色器 發(fā)射單色器 問題： 熒光分光光度計與紫外 可見分光光度計有何異同點 ？ 2022/4/14 紫外 可見分光光度計 : 光源 樣品池 單色器 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 熒光 (磷光 )分光光度計 : 光源 樣品池 激發(fā) 單色器 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 發(fā)射 單色器 2022/4/14 紫外 可見分光光度計 測量池 (吸收池 ) 熒光分光光度計 樣品池 I0 It I0 It IF,p 2022/4/14 （ 一 ） 光源 ? 光源應(yīng)具有強(qiáng)度大 、 適用波長范圍寬 、穩(wěn)定等特點 ? 常用光源有高壓汞燈和氙弧燈 2022/4/14 ? 高功率連續(xù)可調(diào)染料激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光光源的單色性好，強(qiáng)度大。脈沖激光的光照時間短，并可避免感光物質(zhì)的分解 ? 這種光源不需單色器和濾光片 ? 但是儀器設(shè)備復(fù)雜，應(yīng)用還不廣泛 2022/4/14 高壓汞燈光源 應(yīng)用廣泛的 線光源 (nm ) 光源 樣品池 激發(fā) 濾光片 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 發(fā)射 單色器 光源 樣品池 激發(fā) 濾光片 檢測器 數(shù)據(jù)處理 儀器控制 發(fā)射 濾光片 2022/4/14 氙燈光源 波長范圍： 200~800nm 工作壓力： 5~20 atm 啟動電壓： 20~40 KV 使用壽命： 1000~2022 h 應(yīng)用最廣泛的連續(xù)光源 發(fā)射波長范圍寬 發(fā)射光強(qiáng)度大 2022/4/14 （ 二 ） 濾光片和分光器 ? 用濾光片為單色器時 ， 以干涉濾光片的性能最好 ?半寬度窄 ?透射率高 ?經(jīng)得起強(qiáng)光源的長期照射 2022/4/14 ? 較精密的熒光光度計均用分光器作單色器。目前，分光器多采用光柵 ? 光柵有兩個：第一單色器用于選擇激發(fā)波長，第二單色器用于分離出熒光發(fā)射波長 ? 一般是后者的光柵閃耀波長比前者長一些 ? 閃耀波長為光柵最大衍射效率點 ? 選擇光柵時應(yīng)盡量選擇閃耀波長在實際需要波長附近 ? 熒光發(fā)射波長大于激發(fā)波長 2022/4/14 ? 閃耀波長：機(jī)刻光柵的輸出最強(qiáng)光的波長 ? 光柵的線槽角 —— 閃耀角 —— 閃耀波長 2022/4/14 （三） 樣品池 ? 熒光分析的樣品池通常用石英材料做成 ? 與吸光分析法的 樣品 池不同 ? 熒光樣品池的四面均為磨光透明面（ Why?) ? 一般僅有厚度為 1cm的池（ Why?) 使用注意事項 波長范圍 容易破碎 沾污問題 2022/4/14 （ 四 ） 檢測器 ? 簡易的熒光計可采用目視或硒光電池檢測 ? 較精密的熒光光度計均采用光電倍增管檢測 2022/4/14 消除拉曼光譜的干擾的方法有： ① 選用高分辨率的儀器 ② 對純?nèi)軇┑睦?