現(xiàn)代分子生物學蛋白質(zhì)(編輯修改稿)
2025-02-14 02:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 米顆粒：鈦酸鋇（ BaTiO3） 可代替無機熒光染料 用于活組織的成像 熒光染料成像原理： 熒光分子吸收光，發(fā)出比吸收光能量低的熒光 吸收光與散射光的能量差異稱為 Stokes shift， 保證發(fā)出熒光 熒光染料的缺點： 1）細胞本身有許多熒光分子，產(chǎn)生熒光背景 2）熒光顯微鏡的激發(fā)光可能損傷細胞，如紫外光 等；光損傷可能間接發(fā)生，熒光分子與其它分 子發(fā)生反應 解決熒光染料的缺點： 構(gòu)建雙光子顯微鏡（ twophoton microscope） 采用脈沖近紅外線激光，發(fā)出比激發(fā)光能量高 的光 該文：采用第二次諧波產(chǎn)生技術(shù) 發(fā)現(xiàn) barium titanate (BaTiO3)晶體（納米顆粒）， 30 nm 比核糖體的直徑大 2倍 有望代替熒光染料的材料：量子點和納米顆粒 活細胞染色染料 Invitrogen product list C10106 Cellular Lights? TubulinGFP *BacMam * C10112 Cellular Lights? TubulinRFP *BacMam * C10126 Cellular Lights? ActinGFP *BacMam * C10127 Cellular Lights? ActinRFP *BacMam * O10100 Organelle Lights? LysosomesRFP *BacMam * O10104 Organelle Lights? EndosomesGFP *BacMam * O36210 Organelle Lights? MitoGFP *BacMam * O36231 Organelle Lights? EndosomesRFP *BacMam * P36232 Premo? FUCCI Cell Cycle Sensor *BacMam * P36235 Premo? Autophagy Sensor LC3BGFP *BacMam * P36236 Premo? Autophagy Sensor LC3BRFP *BacMam * 2） 標記蛋白技術(shù) 免疫標記法 檢測內(nèi)源性蛋白最常用方法 用特異性抗體（一抗）識別靶蛋白，再用標記有小分子有機染料、藻膽 蛋白或量子點的二抗顯色；或者，直接將熒光標記物或生物素連接 在一抗上，然后再用抗生物素蛋白鏈菌素檢測。 如果沒有高質(zhì)量的抗體，可將熒光標記物與靶蛋白融合過量表達 缺點：該方法只能用于經(jīng)透化處理的細胞、胞外蛋白和可被細胞內(nèi)吞的 蛋白； 抗體標記物的多價性可能會導致靶蛋白形成寡聚體 熒光標記復合體通常分子量會超過 200KD，可能影響蛋白互作 ++、 +/、 分別表示“應用范圍較廣”，“在某些領(lǐng)域內(nèi)有所應用”，“較少應用” 遺傳標記法 熒光蛋白與靶蛋白融合表達，轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因 缺點：表達的蛋白不是內(nèi)源性蛋白 熒光蛋白分子大小會影響目的蛋白功能 熒光蛋白的限制性 改進：靶基因突變株或 RNAi 活細胞內(nèi)或細胞表面將小分子熒光標記物與目的蛋白共價連接或 通過酶進行連接 例：四半胱氨酸序列（ tetracysteine） biarsenical染料系統(tǒng) ● 12aa肽段（含 4Cys）， Cys與透過細胞膜的 biarsenical染 料結(jié)合（高親和力），形成 FlAsH或 ReAsH，發(fā)出綠色或 紅色熒光 ● 同時使用小分子二巰基化合物解毒劑可降低靶蛋白與染料 間親和力，減少毒性反應 ● Tetracysteine對目的蛋白的影響比熒光蛋白小得多 ● 可用于親和純化、熒光蛋白輔助的光滅活作用、檢測蛋白 質(zhì)合成過程、進行脈沖追蹤標記、電鏡定位等 ● biarsenical染料會造成背景熒光偏高，未用于轉(zhuǎn)基因動 物，不能同時對不同的蛋白標記上不同的顏色 phalloidin: actin HaloTag技術(shù) 蛋白標記示蹤 +融合表達 +蛋白分離 具體步驟： HaloTag和目標蛋白的融合 表達載體 ，可按需要選擇瞬時轉(zhuǎn) 染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 共同孵育 560分鐘，配基穿越細胞膜 和 HaloTag形成共價結(jié)合，然后洗掉未 結(jié)合的配基。 ：活細胞熒光成像；或者固 定細胞成像；細胞裂解以及蛋白親和 純化 /捕獲，或凝膠分析。 3）應用 蛋白質(zhì)表達、蛋白質(zhì)定位 流式細胞：蛋白質(zhì)表達、蛋白質(zhì)活性 特異結(jié)合磷酸化蛋白的被熒光標記的抗體，觀察內(nèi)源蛋白 質(zhì)的活化狀態(tài)；熒光標記抗體，檢測蛋白表達 同時對 17種熒光進行檢測 光鏡 /電鏡：蛋白質(zhì)定位 共聚焦顯微鏡觀察 熒光基團在光照下產(chǎn)生單線態(tài)氧，容易對熒光基團自身起漂白作用，而 且可將局部的二氨基聯(lián)苯胺氧化形成電鏡下的嗜鋨小體。 量子點可以用于光鏡和電鏡 A， B 內(nèi)源性蛋白一抗標記、染料 二抗標記 D， E：融合表達熒光蛋白， tetracysteine標記 Different frames from timelapse microscopy are shown for CIDGFP (Drosophila CENPA, centromere marker) coexpressed with H2BmRFP (chromosome counter stain) at 1, 64, 83 and 138 minutes. Purple indicates cell outlines taken by transmission light. 共定位：質(zhì)粒共表達 Caroline Grabbe a
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