常規(guī)分子生物學(xué)操作要點(diǎn)(編輯修改稿)
2025-02-14 01:25 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 M Xba I和 Sac I雙酶切產(chǎn)物。 ORF ? 酶切位點(diǎn) ? 通過克隆載體引入酶切位點(diǎn) ? 通過 PCR引入酶切位點(diǎn) （ 需測(cè)序 ） ? 部分酶切 ? Adaptor的使用 ? 克隆的先后次序 通過克隆載體引入酶切位點(diǎn) 部分酶切 Adaptor的使用 通用植物表達(dá)載體 pBHT5的構(gòu)建 SfiA SfiB 克隆位點(diǎn)的引入 銜接頭設(shè)計(jì) BS1: 5’GATCCGTACGTGGCCATTA3’ BS2: 3’GCATGCACCGGT5’ SS1: 5’CGGCCGACTGGAGCT3’ SS2: 3’GGAGCCGGCTGACC5’ 克隆的先后次序 ? 實(shí)驗(yàn)方法和操作 ? 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 酶切與回收 ? 連 接 ? 轉(zhuǎn) 化 ? 轉(zhuǎn)化子的鑒定 質(zhì)粒 DNA的提取 采用堿變性小量提取法： ? 挑取單菌落，加 5ml含有相應(yīng)抗生素的 LB液體培養(yǎng)基， 37℃ ， 200r/min，振蕩培養(yǎng)過夜。 ? 將菌液加入 ， 4000r/min，離心 5min，盡可能棄去上清。 ? 加 100μL溶液 Ⅰ ，強(qiáng)烈振蕩至細(xì)胞均勻分散，室溫放置 5min。 ? 加 200μL溶液 Ⅱ ，顛倒混勻，動(dòng)作要輕，冰浴 5min。 ? 加 150μL溶液 Ⅲ ，顛倒 2~3次混勻，冰浴 5min。 ? 4℃ ， 12022r/min，離心 10min，將上清移至新管，小心不要將沉淀吸入。 ? 用等體積苯酚 ∶ 氯仿抽提。 4℃ ， 12022r/min，離心 5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚 ∶ 氯仿。 ? 加兩倍體積 95%的冰乙醇，顛倒混勻， 4℃ ， 12022r/min，離心 10min。 ? 用 70%乙醇清洗沉淀。 ? 倒掉乙醇，吹干。 ? 加入適量 TE溶解 ? 電泳檢測(cè)。 酶切與回收 ? 雙酶切體系的建立 ? DNA的質(zhì)量（不需要加大酶量） ? 凝膠重量 ? 回收片段的質(zhì)量（大片段降解？連接比） 連 接 ? 連接體系（需要調(diào)整） ? 載體和 DNA片段的大小 ? PEG的添加（ T載體、平末端連接） ? 連接條件：溫度 （粘性、平末端） ? 4度、 16度、 22度 ? 1M NaCl（轉(zhuǎn)化） 轉(zhuǎn)化子的鑒定 PCR技術(shù)要點(diǎn) ? 引物的設(shè)計(jì) ? PCR反應(yīng)體系 ? PCR反應(yīng)條件 PCR技術(shù) PCR技術(shù)的應(yīng)用 ? 基因的分離和克隆 ? 基因修飾、改造 ? 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)的原則（一） ① 引物長(zhǎng)度： 1530bp， 常用為 20mer左右 ? 引物的有效長(zhǎng)度不能大于 38 mer， 否則最適延伸溫度會(huì)超過 TaqDNA聚合酶的最適溫度 （ 72℃ ） ， 不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性 。 ② 引物擴(kuò)增跨度：以 500bp為宜 ? 特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至 10kb的片段 。 ③ 引物堿基： G+C含量以 4060%為宜 ? G+C太少擴(kuò)增效果不佳 ， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ? ATGC最好隨機(jī)分布 ， 避免 5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。 引物設(shè)計(jì)的原則（二） ④ 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是 3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶 （熱啟動(dòng)PCR） 。 ⑤引物 3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì) ? 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn) ? 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 引物設(shè)計(jì)的原則（三） ⑦ 引物的特異性： ?引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性。 ⑧引物量： ?每條引物的濃度 ~ 1umol或 10 ~ 100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。 ?引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 對(duì)于比較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，多設(shè)計(jì)幾對(duì)引物配合使用是很有效的（巢式 PCR）。 Mg2+濃度 ? Mg2+對(duì) PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響 。 ? 在一般的 PCR反應(yīng)中 ， 各種 dNTP濃度為 200umol/L 時(shí) ， Mg2+濃度為 ～ mmol/L為宜 。 ? Mg2+濃度過高 ， 反應(yīng)特異性降低 ， 出現(xiàn)非特異擴(kuò)增 ，濃度過低會(huì)降低 Taq DNA聚合酶的活性 ， 使反應(yīng)產(chǎn)物減少 。 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間： ? 退火溫度是影響 PCR特異性的較重要因素 ? 變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。 ? 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) ? 在 Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR反應(yīng)的特異性。 （梯度降落 PCR ） ? 復(fù)性時(shí)間一般為 30～ 60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸時(shí)間： 根據(jù)所用 Taq酶種類和待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而
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