【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 豆根瘤菌的共生組合發(fā)揮出 更好的固氮效果，提高大豆產(chǎn)量與土壤肥力，獲得更可觀的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ３ － 1 材料與方法 試驗(yàn)材料 材料 黑龍江地區(qū)的大豆植株 儀器與設(shè)備 離心機(jī)、菌落計(jì)數(shù)器、自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、電恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、超凈工作臺(tái)、可見光光度計(jì)、電子分析天平、燒杯、移液管。 培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)試劑 YMA 固體培養(yǎng)基：甘露醇 10g，酵母粉 3g， MgSO47H2O ， NaCl ， ， pH ，固體瓊脂 15～ 18g； TY 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 5g，酵母粉 3g， CaCl26H2O ， pH ～ ； LB 液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 10g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g，氯化鈉 10g， pH ； Fahraeus 無氮營(yíng)養(yǎng)液：CaCl22H2O ， MgSO47H2O ， ， Na2HPO412H2O ，檸檬酸鐵 ；微量元素液： ， ZnSO4H 2O ， MnSO44H2O ，NaMoO42H2O ， CuSO45H2O （使用時(shí)接 加入 1L Fahraeus 無氮營(yíng)養(yǎng)液中）； 以上培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)液除特殊說明外，配制時(shí)均用蒸餾水定容至 1000mL，在 121℃滅菌 30min。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ４ － 試驗(yàn)實(shí)施方案 根瘤菌的分離和純化 供試的 10 個(gè)菌株自大豆根瘤中直接分離，采用系統(tǒng)分離法分離根瘤菌。 具體分離方法是將植株的根部浸泡沖洗千凈后，用剪子剪下根瘤 ,略帶一小段根，將根瘤用 95%的酒精浸泡 5min 后，再用 3%的 NaCl 溶液浸泡 5min，然后用無菌水沖洗 5 遍，用無菌濾紙將根瘤表面的水吸干后，取其汁液在平板上劃線接種并以經(jīng)過表面消毒的整個(gè)根瘤置于平板中間位置作為對(duì)照，保溫 28e 培養(yǎng)挑取平板上長(zhǎng)出的菌落接于 YMA 斜面上，待斜面上長(zhǎng)出菌苔后 ,采用稀釋平板法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行純化其詳細(xì)情況見表 11。 表 11 供試菌株 編號(hào) 菌株 宿主 土壤類型 R1 MLS1B Glycine max 大豆 BS 黑土 R2 MS2B Glycine max 大豆 BS 黑土 R3 YS3M Glycine max 大豆 ML 草甸白漿土 R4 BX1B Glycine max 大豆 BS 黑土 R5 HAB1 Glycine max 大豆 BS 黑土 R6 MS4M Glycine max 大豆 ML 草甸白漿土 R7 HAB2 Glycine max 大豆 BS 黑土 R8 HL1B Glycine max 大豆 BS 黑土 R9 HL2D Glycine max 大豆 DBE 暗棕壤 R10 LKA Glycine max 大豆 AS 白漿土 Rck JX4D Glycine max 大豆 DBE 暗棕壤 初篩試驗(yàn) 初篩試驗(yàn)以從根瘤中分離的 10 株根瘤菌和黑龍江省優(yōu)質(zhì)大豆為材料供試大豆的詳細(xì)情況見表 12。 初篩試驗(yàn)以河砂為基質(zhì) ,采用雙層缽法進(jìn)行栽培用一紗布條穿過紙杯底部 ,杯中裝有洗凈的河砂 ,將紙杯置于裝有 Fahraeus 無氮植物營(yíng)養(yǎng)液的罐頭瓶口上 ,河砂通過紗布吸取營(yíng)養(yǎng)液 ,以維持砂中植物生長(zhǎng)所需要的濕度杯口用封口膜封口以上裝置采用分別滅菌后在無菌超凈臺(tái)中組裝的 ,河砂 121e 蒸汽滅菌 ,其余裝置 121e 蒸汽滅菌 3Omin。 將經(jīng)過表面滅菌的種子放入無菌平皿中 ,皿底墊上濕潤(rùn)的滅菌紗布 28e 催芽 2d 分別對(duì)催芽后的 4個(gè)大豆品種接種 10株根瘤菌 ,以無 菌水浸種作為對(duì)照 ,播種于雙層缽中置自然光照下培養(yǎng) ,共 44 個(gè)處理 ,3 次重復(fù)。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ５ － 催芽后的種子在菌懸液中浸泡巧而 n,用無菌鑷子夾取植入裝有砂培的杯中 ,在沿各植株根部加入該菌液 2ml,使每個(gè)處理中含菌量達(dá)到 40 億個(gè)設(shè)不接種的種子作為對(duì)照。 接種方法 :浸種 ,取一無菌培養(yǎng)皿加入菌懸液適量再加入發(fā)芽一致的種子 ,浸泡15min用無菌鑷子夾取植入裝有砂培的杯中 ,再沿各植株根部加入該菌液 2ml使每個(gè)處理中含菌量達(dá)到 4 又 10 個(gè) /ml。 表 12 供試大豆 品種編號(hào) 品種名稱 蛋白質(zhì)含量 脂肪含量 引種單位 V1 東農(nóng) 42 % % 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所 V2 東農(nóng) 1168 % % 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所 V3 黑農(nóng) 48 % % 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所 V4 綏農(nóng) 14 % % 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所 優(yōu)選菌株的細(xì)菌學(xué)鑒定 試驗(yàn)采用經(jīng)典分類鑒定方法，包括菌株形態(tài)特征和培養(yǎng)特征觀察生理特性鑒定三部分一內(nèi)容。 盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)所用的兩種土壤均取自于雙城，草甸土取自于雙城市臨江鎮(zhèn) ,黑土取自于雙城市市郊 ,前茬作物均為玉米試驗(yàn)用盆質(zhì) 地為塑料，上口直徑為 30 厘米，盆底直徑為 25 厘米，桶高為 30 厘米每盆裝土 10kg。 試驗(yàn)采用完全設(shè)計(jì)方案分別在草甸土和黑土上對(duì)東農(nóng) 42 和東農(nóng) 1168 接種根瘤菌株R 設(shè)接種菌株，作為接種菌株的陽性對(duì)照 ,不接種為陰性對(duì)照 ,共 20 個(gè)處理 ,6 次重復(fù) ,采用盆栽方法 ,完全隨機(jī)排列 ,在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站內(nèi)進(jìn)行。 接種方法 :采用種子丸衣化方法丸衣材料比例按 10009種子加 1009根瘤菌劑 ,阿拉伯膠液 (1009 阿拉伯膠溶于 225m 一熱水中 )5009 碳酸鈣 ,加鋁酸按 109 配制；首先將根瘤菌劑與膠液混勻 ,然后把種子和拌有根瘤菌的膠 液一起攪拌 ,當(dāng)每粒種子都均勻的拌有根瘤菌劑膠液后加鋁酸按 ,再加入碳酸鈣后不停地?cái)嚢柚钡椒N子完全丸衣不結(jié)塊且包衣均勻?yàn)橐?,做好的丸衣種子避免在陽光下暴曬。 播種 :為了防止根瘤菌污染空白對(duì)照區(qū) ,先播對(duì)照區(qū)的種子 ,然后再播丸衣接種區(qū) ,采用一般田間管理。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ６ － 測(cè)定項(xiàng)目及方法 初篩試驗(yàn) 出苗后 4~5 周，測(cè)定植株干重，株高，根瘤數(shù)，根瘤干重。 盆栽試驗(yàn) 采用乙炔還原法剪下待測(cè)植物的根置于 500ml 三角瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出50ml 空氣，注入 50ml 乙炔，室溫下反應(yīng) 30min 后，從中吸出 4mL 混合氣體放入頂空瓶中，上機(jī)時(shí)用微量注射器從頂空瓶中抽取混合氣體 100 閃注入氣相色譜儀 (GC)進(jìn)樣柱中，測(cè)定 CZHZ!CZH4 峰值 ,重復(fù) 2 次，后在同樣條件下用標(biāo)準(zhǔn)乙烯測(cè)定并繪制乙烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線由此計(jì)算根瘤樣品的固氮酶活，每個(gè)處理做 3 次重復(fù)。 數(shù)據(jù)分析 采用 版 Excel 和相關(guān)的計(jì)算機(jī)其他軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ７ － 2 結(jié)果與分析 初篩試驗(yàn) 結(jié)果表明， 10 個(gè)菌株均能在四個(gè)品種大豆上結(jié)瘤品種 V 除了根瘤數(shù)與 V:差異不顯著外 v,的株高植株干重和根瘤干重都極顯著高于其他 品種 ,品種 V:的植株干重和根瘤干重極顯著高于 V:和叭所以在初篩試驗(yàn)中初步認(rèn)定 V,為最佳品種 ,品種次之初篩試驗(yàn)中，參試菌株對(duì)大豆的株高植株干重根瘤數(shù)和根瘤干重都有極顯著的提高作用，接種菌株 Rl和R:其效果更為顯著，說明這二種菌株與 V:之間有較強(qiáng)的親和力為進(jìn)一步檢驗(yàn)優(yōu)選菌株與優(yōu)選品種的共生有效性及選育出親和力強(qiáng)和適應(yīng)性強(qiáng)的菌株，在盆栽實(shí)驗(yàn)中結(jié)合土壤類型因素以考查根瘤菌與大豆與土壤間的相互適應(yīng)性，進(jìn)而篩選出匹配性更好的優(yōu)良組合。 優(yōu)選菌株 R1 R5 R8的細(xì)菌學(xué)鑒定 優(yōu)選菌株細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果，菌落形態(tài)觀 察 :不同菌株形成不同大小粘稠度和透明度的菌落形態(tài) ,其中菌株 Rl和 RS形成粘稠而呈乳白色的菌落，稱為 M 型；菌株凡和凡 k 形成稀薄而半透明的菌落，稱為 w 型為慢生型根瘤菌，在 反應(yīng)中產(chǎn)堿，在石蕊牛奶中產(chǎn)堿，在含 2%NaCI 的培養(yǎng)基中不能生一長(zhǎng) 。能夠利用檸檬酸鹽，在肉湯蛋白陳中不能生長(zhǎng)，不產(chǎn)生 3 一酮基乳糖。 盆栽試驗(yàn) 供試土壤的自然情況 表 21 供試土壤的自然情況 土類 有機(jī)質(zhì) 全氮 全磷 緩效鉀 堿解氮 速效磷 pH 菌數(shù) g/kg g/kg g/kg mg/kg mg/kg mg/kg NSR/g 黑土 150 草甸土 420 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究 － ８ － 由表 21可見 ,黑土中有機(jī)質(zhì)和堿解氮的含量分別較草甸土高出 46%在其他項(xiàng)目比較中，全磷和速效磷草甸土高于黑土，其他項(xiàng)目均低于黑土黑土 pH 值接近中性，草甸土的 pH 值偏酸性，根瘤菌在兩種土壤中都能進(jìn)行良好結(jié)瘤草甸土中土著根瘤菌的數(shù)量較多，為 420 個(gè) /g 干土，幾乎是黑土中土著根瘤菌數(shù)量的 3 倍黑土和 草甸土中的速效磷和速效鉀的含量等級(jí)都為高，所以說在兩種土壤中不存在磷鉀元素缺乏影響共生固氮的問題。 固氮酶活性 固氮酶活性方差分析結(jié)果表明 ,菌株大豆品種土壤類型及其所有的交互作用對(duì)固氮酶活性的影響均達(dá)到差異極顯著水平從單因素效應(yīng)來看 ,黑土中固氮酶活性高于草甸土，品種 V 植株固氮酶活性高于媽菌株對(duì)固氮酶活性影響的比較結(jié)果對(duì)大豆接種根瘤菌其固氮酶活性都極顯著的高于陰性 CK，說明接種根瘤菌能夠提高植株的固氮能力；菌株 Rl和凡固氮酶活性極顯著高于 Rek,對(duì)大豆接種菌株 Rl其植株生物固氮量最高，說明菌株 Rl生 物固氮能力強(qiáng)于其它菌株。 在黑土中 ,菌株 R,和 RCk與品種 V:和 V:的共生體固氮酶活性極顯著高于兩 CK 處理，但菌株 RS的兩共生體與兩 CK 之間差異不顯著； V1接種菌株 Rl與隊(duì)固氮酶活性之間差異不顯著，但叭接種 Rl其固氮酶活性極顯著高于丸； Vl接種 RS固氮酶活性極顯著低于 RCx,但 V 接種 RS固氮酶活性顯著高于丸在草甸土中，處理固氮酶活性極顯著的高于其他接種處理，并且對(duì) v,和 v:來說，接種菌株的處理固氮酶活性均極顯著的高于 CK 處理。處理之間差異不顯著，但顯著高于其它處理四個(gè)陰性對(duì)照比較結(jié)果表明 ,黑土與兩個(gè)品種間的組合固氮酶活性都高于草甸土與兩個(gè)品種組合，而且他們之間的差異極顯著；黑土與 v,組合間固氮酶活性顯著高于與 V 的組合；草甸土與 V 和 v 組合間固氮酶活性差異不顯著。 酞脈含量 酞脈含量方差分析結(jié)果表明 ,除大豆品種對(duì)酞脈含量差異顯著影響外 ,其他因素及其交互作用對(duì)酞脈含量均達(dá)到差異極顯著性影響從單因素效應(yīng)看 ,黑土中酞脈含量高于草甸土菌株對(duì)酞脈含量影響 ,大豆接種根瘤菌其植株酸脈含量都極顯著的高于 CK,說明接種根瘤菌能夠提高植株酞脈含量 ,而且接種 Rl其植株酞脈含量最高并極顯著高于瓜 ,菌株 R,和 RS酸脈含量極顯著低 于 RCx,說明菌株 R,氮素貯藏和運(yùn)輸?shù)淖疃唷? RV交互作用對(duì)酞脈含量影響的比較結(jié)果見表 22 接種菌與不同大豆品種的組合其酞脈含量均極顯著高于 CK 處理；對(duì)品種 V,接種 R,其酞脈含量極顯著高于 RCk,而接種 RS和S 其酞脈含量極顯著低于凡 k；對(duì)品種 VZ種 R,和 RS其酞脈含量極顯著高于 RCk而 Rs 酞脈含量顯著低于 Rck 從表中還可以看出 ,交互作用酞脈含量極顯著高于其它的交互作用 ,說明 RI與 V,之間組合貯藏和運(yùn)輸?shù)奶}較多 ,此結(jié)果與固氮酶活性相同。 篩選 根瘤菌 菌株與大豆和 土壤間相互適應(yīng)性研究