【文章內(nèi)容簡介】 α 螺旋 、 β 折疊 、 β 轉(zhuǎn)角 、 無規(guī)卷曲 等 β轉(zhuǎn)角 蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu) α螺旋 β折疊片 β轉(zhuǎn)角 自由回轉(zhuǎn) 三級(jí)結(jié)構(gòu) 三級(jí)結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上 進(jìn)一步盤曲而成特定格式的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 四級(jí)結(jié)構(gòu) 很多蛋白質(zhì)分子是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的、具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的。 這些多肽鏈之間只是通過疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)，形成了四級(jí)結(jié)構(gòu)。 在四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，每個(gè)具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學(xué)活性，具有完整四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子才有生物活性。 血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為 α1 、 α β β2 蛋白質(zhì)工程主要包括 4大類研究 ： 第一，利用已知的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息開發(fā)應(yīng)用研究。第二，定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系。這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體，它包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，酶催化的性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等 . 第三，從混雜變異體庫中篩選具有特定結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系的蛋白質(zhì)。 第四，根據(jù)已知結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系的蛋白質(zhì)，用人工方法合成它及其變異體 . 第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程的基本步驟 與改造策略 一、 蛋白質(zhì)工程的基本步驟 （ 1）分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶 ,進(jìn)行分析 ,得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。 （ 2）對(duì)目的蛋白的功能作詳盡的研究，確定它的功能域。 （ 3）通過對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系分析，找出關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)。 (4)圍繞這些關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)提出對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的方案，并用基因工程的方法去實(shí)施。 (5)對(duì)經(jīng)過改造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測定 . 二、蛋白質(zhì)工程的改造策略 疏水氨基酸常常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活動(dòng)中心區(qū)域； α螺旋和 β 折疊區(qū) 通常不會(huì)是酶的活性中心以及底物結(jié)合的中心，而是作為結(jié)構(gòu)的支架；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)域和帶電荷區(qū)域通常位于蛋白質(zhì)的表面。 進(jìn)行定點(diǎn)突變時(shí)，應(yīng)注意保守氨基酸殘基。如果要改變酶活性、底物結(jié)合活性等高度特異性的性質(zhì)，則應(yīng)盡量保留保守殘基。 應(yīng)注意保留潛在的 N糖基化位點(diǎn) (AsnXSer／ ThrXPro)中的 Asn(天門冬酰胺 )、 Set(絲氨酸 )或 Thr(蘇氨酸 )。 對(duì)于含有內(nèi)含子的序列，可以刪除某一外顯子或外顯子組合，因?yàn)閱蝹€(gè)外顯子通常編碼獨(dú)立折疊的結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會(huì)影響蛋白其余部分的正確折疊。 構(gòu)建兩個(gè)同源蛋白的嵌合體時(shí)，應(yīng)盡量使其接合部位處在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而當(dāng)兩個(gè)非同源蛋白組成嵌合體時(shí)，則應(yīng)使接合部分盡量位于所預(yù)測結(jié)構(gòu)的邊緣。 如果對(duì)目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)一無所知，那么可以在目的序列中隨機(jī)插入六聚體接頭以鑒定功能性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個(gè)氨基酸，比插入更多的氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)整體功能的破壞要輕。 進(jìn)行缺失突變時(shí)，應(yīng)避免直接利用天然存在的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行刪除。 第三節(jié) 、 蛋白質(zhì)改造方法 在基因水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，按改造的規(guī)模和程度可以分為： 初級(jí)改造： 個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入 高級(jí)改造 ：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接 從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì) 一、 初級(jí)改造 ?通過 基因突變方法 ，以達(dá)到改變氨基酸進(jìn)而改造蛋白質(zhì)的目的。 ?目前，主要采用的基因突變方法： ?基因定位突變 ?盒式突變 。 ?基因定位突變 根據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼 DNA（目的基因）的確定位點(diǎn)，改變其組成核苷酸的順序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成的氨基酸種類、順序發(fā)生改變，合成出具有預(yù)期氨基酸序列的修飾蛋白質(zhì)。 這種通過造成一個(gè)或幾個(gè)堿基 定點(diǎn)突變 ，以達(dá)到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點(diǎn)突變技術(shù) 。 ?基因定位突變的基本過程 ： 首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對(duì)指定的位點(diǎn)用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最后將突變基因?qū)脒m宜的表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌等 )即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。這是目前定向改造蛋白質(zhì)的基本手段。 （一） M13DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù) 特點(diǎn)： 能夠準(zhǔn)確按照人們的意圖進(jìn)行 DNA突變，即想改變哪一個(gè)堿基就只改變哪一個(gè)，其他的不變 基本過程： 將待研究的基因插入載體 M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個(gè)或幾個(gè)非配對(duì)堿基）作為引物，合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，用 T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯(cuò)配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。 （二） 寡核苷酸介導(dǎo)的 PCR誘變技術(shù) 特點(diǎn)： 利用 PCR技術(shù)定點(diǎn)誘變，可使突變體大量擴(kuò)增，提高誘變率 以研究基因?yàn)槟０?，用人工合成的寡核苷酸（含有一個(gè)或幾個(gè)非互補(bǔ)的堿基）為引物，直接進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。 過程： ?將目的基因克隆到質(zhì)粒載體上，質(zhì)粒分置于兩管中，每管各加入兩個(gè)特定的 PCR引物，一個(gè)引物與基因內(nèi)部或其附近的一段序列完全互補(bǔ)，另一引物和另一段序列互補(bǔ)，但有一個(gè)核苷酸發(fā)生了突變； ?兩管中，不完全配對(duì)的引物與兩條相反的鏈結(jié)合，即兩個(gè)突變引物是互補(bǔ)的。由于兩個(gè)反應(yīng)中引物的位置不同，所以 PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物有不同的末端。 ?將兩管 PCR產(chǎn)物混合、變性、復(fù)性，則每條鏈會(huì)與另一管中的互補(bǔ)鏈退火，形成有兩個(gè)切口的環(huán)狀 DNA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，這兩個(gè)切口均可被修復(fù)。若同一管子中的兩條 DNA鏈結(jié)合，會(huì)形成線性 DNA分子，它不能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，只有環(huán)狀 DNA才能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，而絕大多數(shù)的環(huán)狀分子都含有突變基因。 （三）隨機(jī)誘變技術(shù) （四）盒式突變技術(shù) ?常用方法：將基因克隆到質(zhì)粒上，旁邊有兩個(gè)緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，雙酶解后產(chǎn)生一個(gè)3′ 凹陷的末端和一個(gè) 5′ 凹陷的末端，與克隆基因想鄰的末端是 3′ 凹陷和 5′ 凹陷。 ?1985年 Wells提出的一種基因修飾技術(shù)，可經(jīng)過一次修飾，在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生 20種不同氨基酸的突變體，從而可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸進(jìn)行 “ 飽和性 ” 分析。 利用定位突變?cè)跀M改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和基因上沒有的 內(nèi)切酶切點(diǎn) ，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈 DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。 二、蛋白質(zhì)分子的高級(jí)改造（結(jié)構(gòu)域的拼接） ?研究證明，在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還有一個(gè)結(jié)構(gòu)層次，即 結(jié)構(gòu)域 ?結(jié)構(gòu)域由 α 螺旋、 β 折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單位按一定的拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體。 ?結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中一種基本的結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域拼接是通過基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白的性質(zhì)。 三、全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 ?上述兩種蛋白質(zhì)改造方法，通常是從一個(gè)已知順序、結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)出發(fā)，根據(jù)一定的目標(biāo)和設(shè)計(jì)方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改變它的結(jié)構(gòu)，以期達(dá)到改變其性質(zhì)的目的。 ?如果要從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建一個(gè)自然界不存在的蛋白質(zhì)，則需要借助多功能模板和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組裝成某種具有特定功能的人工蛋白質(zhì)分子。 蛋白質(zhì)工程在食品中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)工程自問世以來，短短十幾年的時(shí)間，已取得了引人矚目的進(jìn)展，在醫(yī)學(xué)和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應(yīng)用前景。 ?提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面 ： ①延長酶的半衰期； ②提高酶的熱穩(wěn)定性； ③延