基因工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-02-12 15:14 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，并進(jìn)行純化。 （ 3） DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，最好是單一酶切位點(diǎn)，并位于 DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點(diǎn)上插入外源 DNA，但不影響載體自身 DNA的復(fù)制。 （ 4）具有能夠觀察到的表型特征，在插入外源 DNA后，這些特征可以作為重組 DNA選擇的標(biāo)志。 載體的報(bào)告基因 （標(biāo)記基因）：基因工程中利用載體上引入的一些具有特殊標(biāo)志意義的基因，可用來(lái)證明載體已經(jīng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，并可用來(lái)將含有目的基因的宿主細(xì)胞從其他細(xì)胞中識(shí)別區(qū)分甚至挑選出來(lái)，這種具有標(biāo)志意義的基因稱為報(bào)告基因（ reporter gene）或標(biāo)記基因。 最常用的報(bào)告基因有抗藥性基因（例如，抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素等抗生素抗性基因）， 此外，還有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ CAT基因）、 β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）、 β 球蛋白基因和人生長(zhǎng)激素基因等。 按照介導(dǎo)的作用目的，可將基因工程載體主要分為 克隆載體 和 表達(dá)載體 。 克隆載體 ：有一個(gè)松弛性復(fù)制系統(tǒng)，能使外源 DNA在受體生物細(xì)胞中擴(kuò)增復(fù)制。（例如，細(xì)菌質(zhì)粒載體、 λ 噬菌體載體、柯氏質(zhì)粒載體） 表達(dá)載體 ：有一個(gè)受體生物細(xì)胞所要求的包括啟動(dòng)子序列在內(nèi)的調(diào)控系統(tǒng)，能使外源基因在受體生物細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。（例如， Ti質(zhì)粒、 SV40猴狀病毒） 按照導(dǎo)入的受體生物，一般可將基因工程載體分為 大腸桿菌（原核細(xì)胞）載體 、 酵母載體 、 植物載體 、 動(dòng)物載體 等。 （一）大腸桿菌載體 質(zhì)粒 :指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì) 。 質(zhì)?？截悢?shù) （ plasmid copy number） ：一種質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)胞中存在的數(shù)目 。 （ 1）質(zhì)粒的生物學(xué)特性 一般為 雙鏈 的 共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA（ ccc DNA），質(zhì)粒分子的長(zhǎng)度一般為 1～ 200 kb。不同質(zhì)粒的分子質(zhì)量差異顯著，小質(zhì)粒的分子質(zhì)量約為 103KDa，僅能編碼 2～ 3種中等大小的蛋白質(zhì)；而大質(zhì)粒的分子質(zhì)量可達(dá) 105KDa。 （ 2）質(zhì)粒的分類 根據(jù)復(fù)制控制類型：一般可將大腸桿菌質(zhì)粒分為 嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒 和 松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒 。 嚴(yán)緊型復(fù)制控制質(zhì)粒 :復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制同步，并與宿主蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，而與 DNA聚合酶 Ⅰ 的活性無(wú)關(guān)。如果宿主蛋白質(zhì)的合成終止，質(zhì)粒與宿主染色體的復(fù)制也停止。每個(gè)宿主細(xì)胞中只能達(dá)到 1至數(shù)個(gè)拷貝。 松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒 :復(fù)制與宿主染色體的復(fù)制不同步，其與 DNA聚合酶 Ⅰ 的活性有關(guān)，而與蛋白質(zhì)的合成無(wú)關(guān)。當(dāng)宿主蛋白質(zhì)的合成終止時(shí)，質(zhì)粒仍可復(fù)制。每個(gè)宿主細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)可達(dá) 10～ 200個(gè)。 （ 3） 質(zhì)?？寺≥d體的條件 ①分子結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)單一限制酶切位點(diǎn)，具有易被檢測(cè)的選擇標(biāo)記基因，且切點(diǎn)位于選擇標(biāo)記基因上。 ② 能插入 、 運(yùn)載一定大小的外源基因 。 ③ 在攜帶外源基因前后在宿主細(xì)胞內(nèi)均能自主復(fù)制 。 ④ 在與外源基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后具有 轉(zhuǎn)化功能 。 ⑤ 分子質(zhì)量小 ， 易于操作 ， 一般為 松弛型復(fù)制控制 。 ⑥ 容易控制 ， 安全可靠 。 現(xiàn)已通過(guò) DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多質(zhì)?？寺≥d體供基因工程應(yīng)用，例如， pBR32 pUC系列等。 （ 4）質(zhì)粒 pBR322 組成 ①氨芐青霉素抗性基因（ ampr） ②四環(huán)素抗性基因（ tetr） ③ DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 優(yōu)點(diǎn) ①分子質(zhì)量小。 ②具有兩種抗菌素抗性基因可供作 轉(zhuǎn)化子 的選擇標(biāo)記。 ③較高的拷貝數(shù)。 （ 5） pUC質(zhì)粒載體 組成 ① 來(lái)自 pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） ②大腸桿菌 β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼 α 肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為 lacZ’基因。 ③氨芐青霉素抗性基因（ ampr），但其核苷酸序列有變化，不含原來(lái)內(nèi)切限制酶的單位識(shí)別位點(diǎn)。 ④位于 lacZ’基因中的靠近 5’端的一段 多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)，但它并不破壞該基因的功能。 優(yōu)點(diǎn) ①更小的分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)。 ②適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。 ③有多克隆區(qū)位點(diǎn)。 （ 1） 噬菌體的生物學(xué)特性 不同種類的噬菌體 （ 顆粒 ） 在外形上差別很大 。 大多數(shù)噬菌體顆粒由呈 20面體的頭部及尾部構(gòu)成 ， 例如 ， λ 噬菌體；還有一些噬菌體顆粒為線狀體形 ， 例如 ， M13。 在結(jié)構(gòu)上 ， 噬菌體顆粒比質(zhì)粒復(fù)雜 。 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì) ， 內(nèi)部是核酸 。 該核酸最常見(jiàn)的構(gòu)型是 線狀雙鏈 DNA， 此外 ， 還有環(huán)狀雙鏈 DNA、 線狀單鏈 DNA、 環(huán)狀單鏈 DNA等 。 （ 2） λ 噬菌體載體 λ 噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。頭部裝載了其整個(gè)基因組 λDNA 。 λDNA 為一長(zhǎng)度約 kb的線狀雙鏈 DNA分子，可以分為三個(gè)區(qū)段：左臂、中央?yún)^(qū)和右臂。在左臂和右臂的 5’處各有 12個(gè)堿基長(zhǎng)的互補(bǔ)單鏈（從而構(gòu)成黏性末端）。當(dāng)λ 噬菌體感染宿主細(xì)胞時(shí)， λDNA 被注入宿主細(xì)胞后會(huì)迅速通過(guò)黏性末端的互補(bǔ)作用形成 環(huán)狀雙鏈 DNA分子 。 λ 噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn) ： ① 可攜帶較長(zhǎng)的外源 DNA片段 。② 重組后的 DNA分子可在體外被包裝成噬菌體顆粒 。 ③ 重組的噬菌體容易篩選和貯存 。 λ 噬菌體的必要基因： λDNA 至少包括 61個(gè)基因 。 其中大約半數(shù)基因參與噬菌體生命周期活動(dòng) ， 位于其左臂和右臂 ， 這類基因稱作 λ 噬菌體的必要基因 。 λ 噬菌體的非必要基因： 另一部分基因在被外源基因取代后并不影響噬菌體的生命周期活動(dòng) ， 位于其中央?yún)^(qū) ， 這類基因稱作 λ 噬菌體的非必要基因 。 cos位點(diǎn) （ cohesiveend site）：由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段。 λ 噬菌體載體的分類 ：根據(jù)插入方式 ， 一般可將 λ噬菌體載體分為 插入型載體 和 置換型載體 。 插入型載體 （ insertion vector）：指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)有一種或不止一種限制酶的單一酶切位點(diǎn)可供外源 DNA插入，而不缺失其本身任何片段的 λ 噬菌體載體。由插入型載體得到的重組 DNA分子都比原載體長(zhǎng)。 插入型載體可容納的外源 DNA片段相對(duì)較小，一般在10 kb以內(nèi)。廣泛應(yīng)用于 cDNA以及小片段 DNA的克隆。 置換型 （ 取代型 ） 載體 （ r
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