第二十五章基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略(編輯修改稿)
2024-11-16 12:41 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 主要有兩種方法： ?5 ′端連續(xù)分析基因表達(dá) （ 5 ′ end serial analysis of gene expression, 5 ′ SAGE） ?帽分析基因表達(dá) （ cap analysis gene expression, CAGE） 目 錄 (1) 5 ′ SAGE ?5′SAGE是在 PCR過程中將 MmeI酶切位點(diǎn)引物 cDNA的 5′端，通過酶切和連接獲得不同短片段重復(fù)序列，并對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行測(cè)序獲得大量片段序列信息 ?不同序列的短片段代表不同基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) (TSS) MmeI: ?是一種特殊的 II型限制性核酸內(nèi)切酶 ?識(shí)別的序列不是回文結(jié)構(gòu)，而是 不對(duì)稱的 DNA序列 5′TCCRAC3′（ R代表 G或 A） ?在識(shí)別位點(diǎn)下游 18~20堿基處切開雙鏈 DNA 目 錄 Gppp AAAAAAAAn mRNA 用 BAP和 TAP處理 AAAAAAAAn p 在 RNA的 5?端加上寡核苷酸帽 AAAAAAAAn 5? XhoI MmeI 反轉(zhuǎn)錄酶 RT 5? AAAAAAAAn 5? cDNA PCR Biotin標(biāo)記引物 隨機(jī)引物 5? 5? Biotin MmeI 酶切消化 5? 20 mer 5? Biotin 親和素 用親和素 生物素，可以將 5?端 片段與其他片段分離開 目 錄 5? 20 mer 連接 5? Biotin 5? Biotin 5? 20 mer PCR擴(kuò)增 5? 5? Biotin 5? Biotin 5? XhoI 酶切消化 自身連接 串聯(lián)體 測(cè)序分析 目 錄 (2) CAGE CAGE與 5′SAGE非常相似 所不同的是 : ?CAGE不需要在 RNA上加接頭 ， 而是用 oligo(dT)引物先進(jìn)行第一鏈 cDNA的合成 ?然后通過捕獲帽結(jié)構(gòu)，將含有 MmeI和另一內(nèi)切酶位點(diǎn)如 XmaJI的 linker加到單鏈全長 cDNA的3′末端 目 錄 AAAAAAn Cap mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Oligo (dT)15~18 AAAAAAn Cap TTTTTTTn cDNA 捕獲 5?帽結(jié)構(gòu) 單鏈 linker 連接 TTTTTTTn Biotin cDNA第二鏈的合成 TTTTTTTn AAAAAAn MmeI XmaJI MmeI 酶切 親和素 20 mer 用親和素 生物素，可以將 5?端片段與其他片段分離開 目 錄 連接第二個(gè) linker XbaI XmaJI XmaJI, Xbal 酶切消化 PCR（用 linker1和 linker2作引物） Linker 1 Linker 2 純化，串聯(lián)連接，克隆 20 mer XmaJI和 XbaI是同尾酶： XmaJI： C^CTAGG XbaI： T^CTAGA 串聯(lián)體 測(cè)序分析 目 錄 第三節(jié) 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及功能分析 目 錄 主要內(nèi)容： 一、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析 二、啟動(dòng)子的功能分析 目 錄 啟動(dòng)子（ promoter） ?是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別的、參與特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 DNA序列 ?II型啟動(dòng)子通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游 ?共通序列 (consensus sequence)是其特征性序列 ?共通序列和啟動(dòng)子所處的位置是研究啟動(dòng)子的重要線索 目 錄 +10 +20 Start site 10 20 30 40 +1 ATG 3 +5 Initiator 共通序列 例如： ?原核基因的共通序列： 10區(qū)： Pribnow box（ T77A76T60A61A56T82序列） 35區(qū)： T69T79G61A56C54A54 序列 ?真核基因的共通序列： 真核基因啟動(dòng)子在 50區(qū)域附近 （ 大約 5%~30%基因啟動(dòng)子在 25~30區(qū)域 ） 有 TATA box（ TATAAA序列 ） TATAAT TTGACA 目 錄 一、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析 主要方法： ?利用 PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子 ?利用核酸 蛋白質(zhì)相互作用方法研究啟動(dòng)子 ?生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子 目 錄 （一）利用 PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子 特異性基因序列 基因上游序列 基因組 DNA 根據(jù)基因序列合成一條反向引物 正向引物用隨機(jī)引物 PCR擴(kuò)增 隨機(jī)引物 特異引物 克隆及測(cè)序分析 注意： ?真核基因有內(nèi)含子 ， 應(yīng)該根據(jù) mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物 ?特異性引物盡可能靠近基因的 5?端 1. 根據(jù)已知基因序列直接進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 目 錄 2. 利用 TSS釣取啟動(dòng)子 AAAAAAn Cap 5? mRNA 反轉(zhuǎn)錄 AAAAAAn TTTTTTn cDNA 插入載體，克隆擴(kuò)增 Cap 5? 以基因特異引物與載體引物配對(duì) PCR擴(kuò)增 5? 測(cè)序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列 以 TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機(jī)引物配對(duì)進(jìn)行 TSS上游序列的 PCR擴(kuò)增 目 錄 3. 利用環(huán)狀 PCR釣取啟動(dòng)子 基因組 DNA 酶切消化 基因組 DNA片段 直接環(huán)化連接 加上接頭后環(huán)化連接 根據(jù)基因上游序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向互補(bǔ)引物 PCR擴(kuò)增 根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物 PCR擴(kuò)增 克隆 測(cè)序分析 克隆 測(cè)序分析 ?加接頭環(huán)化 PCR不依賴特異基因序列 ?可用于篩選啟動(dòng)子 接頭 目 錄 （二）利用核酸 蛋白質(zhì)互作方法研究啟動(dòng)子 ?啟動(dòng)子是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合的 DNA序列 ， 因此 ， 能夠檢測(cè)核酸 蛋白質(zhì)相互作用的研究方
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