第二十五章病毒感染的實驗室診斷與防治原則doc(編輯修改稿)
2025-08-14 13:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。4．血清學(xué)鑒定 用已知的診斷血清來鑒定。補體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。三、病毒核酸及抗原的直接檢出（一）直接檢出病毒核酸1．核酸雜交（Nucleic acid hybridization） 臨床病毒學(xué)中報速診斷方法通常是檢測標本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交 (Dot hybridization) 廣泛用于檢測呼吸道標本，尿標本中的病毒核酸。標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進行鹼變性處理后，有放射標記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經(jīng)熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標本中的病毒DNA，也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。2．多聚酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個循環(huán)，可使1個拷貝的核酸擴增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標本，有較大應(yīng)用前景。（二）直接檢測病毒抗原1．免疫熒光（IF）技術(shù) 如前所述IF可用于細胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原；間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標本中抗原結(jié)合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識別抗原。可取咽喉脫落細胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標本，檢測單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。2．免疫酶法（IEA） 原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶（通常是過氧化物酶）取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。3．放射免疫測定法（RIA） 有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗，將形成的復(fù)合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與系列稀釋的標準抗原測定結(jié)果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。4．酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 先將特異性抗體包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實驗室采用。此外，對難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。四、特異性抗體的檢測特異性抗體的檢測病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應(yīng)答，特異性抗體效價升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價值。（一）補體結(jié)合試驗（CF） CF分二個階段：（一個為已知，一個為待檢）混合，加入定量補體，若抗原與抗體相對應(yīng)，則補體被消耗；，若補本已與抗原抗體復(fù)合物完全結(jié)合，沒有剩補體存在，那么綿羊紅細胞不會溶血，結(jié)果為陽性，說明待檢標本中有特異性存在，出現(xiàn)陽性結(jié)果時血清標本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結(jié)果。由于補體結(jié)合抗體產(chǎn)生早，消失快，適于診斷病毒近期感染。（表235）。取血時期 血清稀釋倍數(shù)及試驗結(jié)果 抗體效價 1：21：41：81：161：321：641：128發(fā)病2～3內(nèi)血清發(fā)病2～3周后血清 + + ++ ++++
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