【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 程度與病毒毒株及共感染的免疫抑制類疾病密切 相關(guān) [78]。 禽流感（ Avian Influenza， AI）是由Ａ型流感病毒（ Avian Influenza Virus， AIV）引起的從呼吸系統(tǒng)病變到全身敗血癥的一種高度接觸性急性傳染病，已導(dǎo)致家禽及鳥(niǎo)類白羽肉雞多器官亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究 3 的普遍感染并對(duì)人類造成了嚴(yán)重的威脅 [9]。 目前，在亞細(xì)胞水平的研究結(jié)果表明： NS1 蛋白（ Nonsreuctural Protein 1， NS1）是 A 型流感病毒惟一的非結(jié)構(gòu)蛋白，由第 8 個(gè)基因編碼，可編碼 202 個(gè)～ 237 個(gè)氨基酸（ Amino Acid， AA），在調(diào)節(jié)流感病毒的致病性及毒力方面發(fā)揮著重要的 作用，它可能是 H5N1 亞型禽流感病毒高致死率的關(guān)鍵所在 [10]。在 朱春玉等研究禽流感病毒 NS1 蛋白亞細(xì)胞定位中顯示 NS1 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)呈聚集趨勢(shì) [11]。 透射電子顯微鏡概述 顯微鏡都是被人們用來(lái)觀察人肉眼不能識(shí)別清楚的微小物體，將其放大成像的光學(xué)器材。由于分辨能力的緣故，亞顯微及超微結(jié)構(gòu)必須應(yīng)用電子顯微鏡才能達(dá)到清楚觀察的目的。 1665 年復(fù)合顯微鏡和 1937 年透射式電子顯微鏡誕生。 自 1932 年德國(guó)柏林大學(xué) 等人制造的第一臺(tái)實(shí)用電子顯微鏡，到高性能多功能電子顯微鏡的普遍使用 ，為 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究開(kāi)創(chuàng)了新階段。 1953 年瑞典人制造出優(yōu)質(zhì)的超薄切片機(jī)，和隨后出現(xiàn) 的各種電子染色方法，使超薄切片技術(shù)的得到成熟和完善； 也 迅速推動(dòng)了電子顯微鏡技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。 目前 ， 生物電子顯微鏡技術(shù)已由細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平和原子水平的結(jié)構(gòu)測(cè)定上。英國(guó)醫(yī)學(xué)委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的 博士將高分辨電子顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于生物大分子的結(jié)構(gòu)測(cè)定上，由于他在核酸 蛋白質(zhì)復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)研究方面作出的卓越貢獻(xiàn)，榮獲了 1982 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 透射電子顯微鏡成像原理 普通光學(xué) 顯微鏡是用可見(jiàn)光作光源，照射到樣品上，然后收集處理所得到的光信號(hào)，形成放大像。電子顯微鏡則是用一束具有較高能量的電子，代替可見(jiàn)光照射到樣品上，然后收集處理所得到的信號(hào)，形成放大像。電子束在通過(guò)電磁場(chǎng) (電磁透鏡 )時(shí)發(fā)生曲折，與可見(jiàn)光在通過(guò)玻璃透鏡時(shí)遵守同樣的幾何光學(xué)定律。分辨率與所用光源的波長(zhǎng)有密切關(guān)系。電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光，所以它的分辨能力也就遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。這就是所有電子顯微鏡 (不論是透射的還是掃描的電子顯微鏡 )與光學(xué)顯微鏡的主要區(qū)別?，F(xiàn)代透射電鏡整體包括：電子光學(xué)系統(tǒng) 、 真空系統(tǒng) 、 電氣系統(tǒng) 、 水冷卻循環(huán) 系統(tǒng)和壓縮空氣系白羽肉雞多器官亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究 4 統(tǒng)等。顯微鏡主體是電子光學(xué)系統(tǒng)， 即 鏡筒?？紤]到機(jī)械穩(wěn)定性，真空度易保性，電鏡鏡筒都制成直立式的，自下而上由一個(gè)個(gè)電磁透鏡壘起來(lái)。目前， 比較主流的 透射鏡筒是 68 級(jí)成像透鏡 、 電子槍室和觀察室等組成 ，如本研究采用的日立 H7650。 陰極燈絲在加熱電流作用下 發(fā)射電子束，該電子束 在 陽(yáng)極加速 器下加速 向下高速運(yùn)動(dòng)， 途經(jīng) 第一 、二 聚光鏡 的 會(huì)聚作用 讓 電子束聚焦在樣品 表面 ，電子束 透過(guò)樣品后，再通過(guò) 物鏡、第一 、二 中間鏡和投影鏡 ， 四級(jí)放大后 成像于 熒光屏上。這四級(jí)放大透鏡各級(jí)放大倍數(shù)的乘積就是 電鏡總的放大倍數(shù)，因此透 射電鏡有著更高的放大范圍（ 2021x1000000x）。 TEM 制樣技術(shù) 在透射電鏡生物樣品的制備技術(shù)中，超薄切片技術(shù)是最關(guān)鍵的一環(huán)。目前應(yīng)用的冷凍切片技術(shù)，電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、以及電鏡放射自顯影技術(shù)等都是以超薄切片技術(shù)為基礎(chǔ)的。 TEM 在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中起著越 來(lái) 越重要的作用 ,是 研究 超微結(jié)構(gòu)的重要手段。因 生物醫(yī)學(xué)研究 種類的繁多和樣品制作的特殊性，使得制作過(guò)程繁多而復(fù)雜 ,也 對(duì) 樣品的 取材、固定、脫水、包埋 和 切片等一系列程序提出了嚴(yán)格 的 要求 [12]。目前，本實(shí)驗(yàn)室透射電鏡樣品的制備的過(guò)程 包括組織的固定和包埋、玻璃刀的制作、包埋塊的修正、切片、半 薄 切片的染色、超薄切片的染色。 而 TEM 技術(shù)中提到的“超薄切片”， 是指使用超薄切片機(jī)切割已經(jīng)過(guò)樹(shù)脂包埋過(guò)的樣品，且保證厚度在 以下的切片。切片的質(zhì)量要確保薄而均勻，片子沒(méi)有皺折、無(wú)鉆石刀碎裂刀痕、震顫等缺陷。尤其在制作過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，要力求細(xì)胞微結(jié)構(gòu)保存良好，無(wú)人為假象。染色要深淺適宜，避免沉淀與污染且具有良好的反襯度。 生物樣本在離開(kāi)活體的正常環(huán)境之后 ,其組織結(jié)構(gòu)在自溶酶作用下會(huì)迅速發(fā)生各種“死后”變 化。為了保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的活體狀態(tài) ,組織必須從活體取得后，在最短時(shí)間內(nèi)投入固定液 ,一般不超過(guò) 1 分鐘。本實(shí)驗(yàn)室采用戊二醛及鋨酸雙固定法。固定的目的在于使離體組織盡量保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。組織包埋是電鏡制樣過(guò)程的重要環(huán)節(jié) 。 白羽肉雞多器官亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究 5 切片刀的好壞是決定超薄切片質(zhì)量的重要器材。 50 年代開(kāi)始使用玻璃刀，因其鋒利，制作方便，且價(jià)格便宜，被普遍采用。玻璃刀可用手工或制刀機(jī)制作。 聚合好的包埋塊，在制片前，用刀片修成適當(dāng)?shù)拇笮『捅阌谇衅慕鹱炙螤睿⑹蛊渲械慕M織塊準(zhǔn)確露出表面。必須 除去組織周圍多余的包埋介質(zhì)或無(wú)關(guān)的部分。 生物樣品的超薄切片，反差很弱，在電鏡下無(wú)法看清細(xì)胞結(jié)構(gòu)，必須進(jìn)行提高反差的處理，這種提高反差的辦法通稱“電子染色”。染色經(jīng)常在置于銅網(wǎng)上的超薄切片上進(jìn)行。一般都是用重金屬鹽 檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾 進(jìn)行染色。 白羽肉雞多器官亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究 6 實(shí)驗(yàn) 材料 實(shí)驗(yàn)于 4 月 12 號(hào)在黑龍江大學(xué)農(nóng)學(xué)樓 605 室，對(duì) 3 月齡 白羽肉雞活體取鮮活樣本 ，包括心臟、肺、胃、大腸、小腸、皮膚、腿肌和肝臟 。 實(shí)驗(yàn)器材及試劑 手術(shù)刀、眼科 剪、眼科鑷、離心管、培養(yǎng)皿、解剖臺(tái)、 分析天平、精密酸度計(jì)、移液槍、容量瓶、雙面刀片、載玻片、玻璃棒 、 燒杯 、 量筒、干燥箱、包埋模板、牙簽、試劑瓶 、切片機(jī)（ Leica EM UC6）、制刀機(jī)（ Leica EM KMR 2） 、透射電子顯微鏡（日立 H7650）、玻璃刀、帶膜載網(wǎng)、鐘表鑷子、濾紙 、 膠頭滴管、 蠟紙、 1%餓酸固定液、 %戊二醛、 磷酸緩沖液 、 蒸餾水 、 95%酒精、純酒精、環(huán)氧丙烷、環(huán)氧樹(shù)脂 Epon81 MNA（甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐）、 DDSA（十二烷基琥玻酸酐）和 DMP30（ 2,4,6二甲氨基甲基苯酚） 、 天青 Ⅱ 、 中性品紅、醋酸鈾、檸檬酸鉛、硝酸鉛、氫氧化鈉 。 實(shí)驗(yàn)方法 ，用醫(yī)用酒精對(duì)手術(shù)刀、眼科鑷等器具擦拭，之后活體宰殺。 （心、肝、肺、皮