【文章內(nèi)容簡介】 砒霜的 68 倍。黃曲霉毒素有很強的致癌、致畸和致突變作用， 1993 年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（ WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為 1 類致癌物。 因黃曲霉毒素而引起的人類急性中毒事件，國內(nèi)外已有許多報導，其中最早要追溯到 20 世紀 60 年代發(fā)生在英國的火雞突發(fā)性死亡事件，該事件導致了近10 萬只火雞的死亡，追查其原因，罪 魁禍首就是發(fā)生了霉變的花生餅飼料。 大米是我國南方地區(qū)人民的主食，結(jié)合南方地區(qū)相對濕度較大的環(huán)境以及黃梅季節(jié)的氣候，大米是很容易被黃曲霉素污染的食品之一，并且大米中的黃曲霉素可經(jīng)攝食直接進入人體，危害人類健康。因此，加強對黃曲霉毒素的檢測是十分有必要的。 本文主要通過利用 ELISA 方法，檢測大米農(nóng)作物是否被黃曲霉菌寄生產(chǎn)生黃曲霉毒素所感染。探討了 ELISA 測定食品樣品過程中提取液 PH 值、含鹽量、油脂含量對檢測結(jié)果的影響，初步證實了影響的存在，同時有一定的溶劑萃取提取液可消除這些影響，為建立不同食品樣品中黃曲 霉毒素的提取方法提供了理論依據(jù)。 . 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 黃曲霉毒素是一組化學結(jié)構(gòu)類似的化合物，已分離鑒定出 12 種包括 B BG G M M P Q、 H GM、 B2a 和毒醇，其中 B1的致癌性最強?，F(xiàn)在已有許多資料證明了 AFB1 對動物的毒性中毒機理。 AFB1 可引起肝炎和肝癌、肝組織和膽管增生，病人的主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、厭食和昏睡等癥狀，最終因肝腎衰竭而死亡。因此，掌握黃曲霉毒素的檢測方法對食品安全檢測具有重要的意義。 目前黃曲霉毒素的測定方法主要有薄層分析法、高效液相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免 疫吸附法、免疫親和層析柱 高效液相色譜法、免疫親和層析柱 熒光光度計法等。它們有各自的優(yōu)缺點，黃曲霉毒素的檢測目前多采用試劑盒檢測法，因為試劑盒檢測簡便、費用低、快速，且能定性和定量進行分析。真菌毒素檢測中國計量學院本科畢業(yè)論文 試劑盒的工作原理是薄層色譜法或免疫化學法。 本文的課題是“通過 ELISA 法對大米樣品中黃曲霉素含量的研究”，也就是通過酶聯(lián)免疫吸附法。 . 研究內(nèi)容 本課題研究利用 ELISA 方法，檢測大米農(nóng)作物是否被黃曲霉菌寄生產(chǎn)生黃曲霉毒素所感染。探討了 ELISA 測定食品樣品過程中提取液 PH 值、含鹽量、油脂含量對檢測結(jié)果的 影響，初步證實了影響的存在，同時有一定的溶劑萃取提取液可消除這些影響，為建立不同食品樣品中黃曲霉毒素 B1 的提取方法提供了理論依據(jù)。中國計量學院本科畢業(yè)論文 2. 材料與儀器 . 實驗材料 . 樣品 大米（研磨成粉） . 實驗試劑 甲醇； 三氯甲烷； 石油醚； 無水 Na2SO4； NaCl； PBS 磷酸鹽緩沖液（ ） . 實驗儀器 酶標儀（ MK 芬蘭雷勃公司）； 小型粉碎機（上海淀久中樂機械制造有限公司）； 微量振蕩器（深圳市威斯比生物科技發(fā)展公司）； 微量移液器；（上海佳安分析儀器廠） 恒溫水浴鍋；（常州智博瑞儀器制造有限公司 ） 分析天平；（上海滬粵明科學儀器有限公司） 分液漏斗； 蒸發(fā)皿； 移液管； 容量瓶； 磨口三角瓶； 定量濾紙； ELISA 快速測試盒；（北京智云達科技有限公司） 中國計量學院本科畢業(yè)論文 . 實驗原理 ELISA 分析方法建立的基本原理是直接競爭 ELISA，即根據(jù)抗體和抗原之間的特異性免疫學反應，最后用測定酶活力的方法來增加測定的靈敏度。 操作步驟如下：首先將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗去未結(jié)合的剩余抗體。待測管中加受檢樣品和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。若受檢樣品中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結(jié)合； 若受檢樣本中含有抗原，則與酶標抗原共同競爭固相抗體。受檢樣品中抗原量越多，則由這些抗原與固體抗體結(jié)合的機會越多，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。洗滌除去標記和為標記的游離抗原，加底物顯色，在一定時間內(nèi)終止反應，顏色深淺與抗原量呈負相關(guān)。原理如圖 1 所示。 圖 1 檢測黃曲霉毒素 ELISA競爭法的原理示意 . 樣品提取 參考相關(guān)文獻的方法進行制備，將固體樣品（大米）粉碎后，過 20 目篩網(wǎng)，混合均勻，用四分法進行取樣。樣品處理：準確稱取 20g 的大米樣品置于 250ml的磨 口三角瓶中，加入 100ml 甲醇水（ 55+45）溶液，振蕩 15min，過濾，棄去初濾液。準確吸取 20ml 濾液（相當于 4g樣品）于 250ml 分液漏斗中，加入 80ml三氯甲烷，加塞振蕩 5min，靜置分層（約 30min）放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約 20g 預先用三氯甲烷濕潤的無水 Na2SO4定量緩慢濾紙漏斗過濾于 100ml 蒸發(fā)皿中，再加入 10ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗滌過濾漏斗，洗液并入蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放入通風櫥，于 65℃水浴上通風揮干后，冷卻。準確加入 20ml 甲醇水（ 1： 1）溶液，充分溶解凝結(jié)物，即為待測樣品提取液。 中國計量學院本科畢業(yè)論文 . AFB1 樣品制備 用甲醇將 AFB1 配制成 1mg/ml 溶液，再用甲醇 PBS 溶液（ 20+80）稀釋至約 10μg/ml，紫外分光光度計測定溶液（ 361nm）的光密度值，代入下式計算： X=A*M*1000*f/E 式中： X— 該溶液中 AFB1 的濃度， μg/ml A— 測得的光密度值 M— AFB1 的分子量 312 E— 摩爾消光系數(shù)， 21800 f— 使用儀器的校正因素 根據(jù)計算將該溶液配制成 10μg/ml 標準溶液，檢測時，用甲醇 PBS 溶液將該標準 溶液稀釋至所需濃度（ 、 、 、 1μg/ml、 5μg/ml、10μg/ml）。 . ELISA 檢測步驟 從冰箱中取出黃曲霉毒素 B1 酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫。用 酶標稀釋液稀釋凍干酶標抗原，充分搖勻，制成實驗用酶標抗原溶液。洗滌抗體板條2 次，拍干后備用。 選擇數(shù)孔分別加入 50μlAFB1系列標準溶液，其余孔中各加入 50μl 待測樣品提取液，隨即在各孔中分別加入 50μl 酶標抗原溶液，搖勻， 37℃ 避光溫育 30min。 3．顯色 將溫 育后的抗體板取出，棄去未反應抗原溶液，用洗液洗滌 5 次，每次間隔2 分鐘。拍干后各孔中分別加入 50μl 底物液和 50μl 顯色劑， 37℃顯色 15 分鐘。往各孔中分別加入 50μl 終止液。 4．測定 終止反應后，立即用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔 OD 值，并繪制標準曲線，計算出樣品中的 AFB1含量。 . 提取方法的優(yōu)化 參照國際（ GB/T ）并加以改進準確稱取 大米樣品（已粉