目的基因的克隆與基因文庫的構建(編輯修改稿)
2025-06-15 21:34 本頁面
【文章內容簡介】 A聚合酶擴增的 PCR產(chǎn)物中，其 3’ 末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是 A， 因為 Taq DNA聚合酶對 dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取 TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的 T載體 克隆 PCR克隆目的基因的基本程序 5’ 5’ A A T T 5’ 5’ PCR擴增產(chǎn)物 T 載體 T7 lacZ MCS ori Apr D 化學合成法 5 目的基因的克隆與基因文庫的構建 化學合成法的基本戰(zhàn)略 化學合成的單元操作 DNA化學合成的用途 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 化學合成目的基因的前提條件是基因的 DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略： 小片段粘接法： 混合退火 根據(jù)目的基因全序列，分別合成 1215堿基長的單鏈 DNA小片段 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 補釘延長法： 混合退火 根據(jù)目的基因 兩條互補鏈 全序列，分別合成 1215堿基長的單鏈DNA小片段以及 2030堿基長的單鏈 DNA中片段 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根據(jù)目的基因 的 全序列，分別合成 4050堿基長的單鏈 DNA片段 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 化學合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學合成 DNA的 單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為 95%則合成 50個堿基長的 DNA單鏈大片段的總收率只有 % 化學合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其 編碼的 DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或 cDNA法得到 的重組子，最終獲得含有目的基因的 目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有 簡并密碼子 ，故在探針序列的設計時 必須考慮下列問題： 生物體對簡并密碼子的 偏愛性 ， 合成系列探針 探針應具有足夠的長度，通常在 1720個核苷酸之間 探針內部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域 化學合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 某段連續(xù)的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的 DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 設計的簡并探針序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外還可以參考各種生物體的 EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計 expressed sequence tag 化學合成的單元操作 化學合成 DNA的實質是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去 ， 每接一個單體就是一個循環(huán)反應 ， 包括： 基團保護 、分離 、 縮合 、 分離 、 去保護 五大操作單元 。 從反應機理上來講， DNA化學合成有 磷酸二酯法 、 磷酸三酯法 、 亞磷酸液三酯法 ；具體操作過程又有 液相合成 和 固相合成 兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應中間物的分離程序簡便， DNA合成儀就是根據(jù) 固相亞磷酸液三酯法 原理設計的 化學合成的單元操作 OHGHH HHOCH2OD M TPOMeNCHMeMeCHMeMeO H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 縮合 氧化 脫取代基 玻璃珠 連接臂 DNA化學合成
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