目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建-全文預(yù)覽
【正文】 鏈 引物 退火 逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸 NaOH 自身引導(dǎo)法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會有幾對堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置換合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會有幾對堿基缺失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase cDNA第二鏈的合成 dCTP TdT 引導(dǎo)合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 雙鏈 cDNA的克隆 雙鏈平頭的 cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接， 但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾， 最好是 AT同聚物尾，這樣重組 分子可通過加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口， 以便插入片段回收 cDNA法分離目的基因的基本程序 完備分離程序 提取細(xì)胞總 mRNA， 合成總 cDNA， 將之全部克隆 ， 然后借助于合適的篩選手段找到 目的重組子 篩選時 ， 若使用的是多拷貝載體 ， 則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體 ， 則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于 mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子 VIII基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序 特異分離程序 提取細(xì)胞總 mRNA， 瓊脂糖凝膠電泳分離 ， 回收目標(biāo)mRNA， 由此合成雙鏈 cDNA， 然后進行克隆 特異分離程序較適用于 mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序 差異分離程序 利用兩組細(xì)胞 mRNA種類的差異，分離克隆差異 mRNA所對應(yīng)的 cDNA， 因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠 FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。5 目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 C PCR法 B cDNA法 A 鳥槍法 D 化學(xué)合成 法 E 基因文庫的構(gòu)建 5 目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 基因工程或 DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調(diào)控機制和生物學(xué)功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 染色體 DNA的切斷 超聲波處理： 片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載 體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限
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