【文章內(nèi)容簡介】 變化的意義，并探討 MSLN和 CA125互補應(yīng)用的價值。對有腹水的患者，分析腹水中 MSLN的濃度。 3． 用免疫熒光法分析一些卵巢癌細(xì)胞系的 MSLN 和 CA125 的表達(dá)定位。用雙重?zé)晒鈽?biāo)記借助共聚焦顯微鏡觀察 MSLN和 CA125的定位和共表達(dá)情況。 4． MSLN和 CA125對卵巢癌細(xì)胞生長、增殖和凋亡的影響。 5． 卵巢癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞的黏附實驗：降調(diào) MSLN和 CA125 蛋白質(zhì)的表達(dá)，將已經(jīng)降調(diào)了 MSLN和CA125 的 卵巢癌細(xì)胞系作為實驗組，與未處理的卵巢癌細(xì)胞系為對照，進(jìn)行體外卵巢癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞的黏附實驗，觀察 MSLN和 CA125對人體卵巢癌細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞黏附的影響。 6． 異種細(xì)胞黏附實驗：由于迄今僅有鼠的 MSLN 的封閉抗體，所以本課題應(yīng)用異型細(xì)胞黏附實驗觀察在表達(dá) MSLN和 CA125的細(xì)胞間的黏附過程中 MSLN所起的作用。 7． 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：將表達(dá) MSLN和 CA125和被降調(diào)了 MSLN和 CA125表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞注入雌裸鼠的腹腔，建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，觀察 MSLN 和 CA125 在人卵巢 癌轉(zhuǎn)移過程的作用。 研究目標(biāo)： 用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫組織學(xué)技術(shù)，分析間皮素（ mesothelin, MSLN）在臨床各期卵巢癌患者的血清、腹水、組織標(biāo)本中的分布表達(dá)，探討 MSLN 與卵巢癌臨床分期、荷瘤量和疾病進(jìn)展的關(guān)系、與傳統(tǒng)指標(biāo) CA125 表達(dá)及定位的關(guān)系，最終總結(jié) MSLN 是否可作為卵巢癌早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病情監(jiān)測標(biāo)記物， MSLN 是否可以和 CA125 互補應(yīng)用于卵巢癌的診斷和病情監(jiān)測。初步探討MSLN 的在卵巢癌細(xì)胞生長增殖、黏附和腹腔種植轉(zhuǎn)移的作用，揭示 MSLN 與 CA125 的功能關(guān)聯(lián)性，為 卵巢癌獨特的腹腔生長轉(zhuǎn)移行為提供理論依據(jù)，為抗腹腔轉(zhuǎn)移治療打下基礎(chǔ)。 擬解決的關(guān)鍵問題： 1 目前尚無系統(tǒng)研究 MSLN 用于卵巢癌的診斷和病情監(jiān)測的報告，因此，本研究要解決的首要問題是MSLN 是否有作為卵巢癌的診斷標(biāo)記物的價值。這一問題的解決也為今后研究 MSLN 對子宮內(nèi)膜異位癥等與腹膜間皮細(xì)胞有關(guān)的疾病的診斷價值打下基礎(chǔ)。 2 最新研究提示（ 20xx 年 3 月）人 CA125 是鼠 MSLN 受體，因此，研究人體細(xì)胞 MSLN 和 CA125 的表達(dá)定位關(guān)系及其與卵巢癌疾病狀態(tài)的關(guān)系非常重要。在明確這一問題的基礎(chǔ)上，將為臨床 互補使用這兩個指標(biāo)提供理論依據(jù)。 3 卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移途徑是直接在腹腔的腹膜種植形成轉(zhuǎn)移灶，腹膜間皮是人體表達(dá) MSLN 的主要細(xì)胞。卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后同時出現(xiàn) CA125 和 MSLN，而 CA125 可能是 MSLN 的受體。這一重要線索提示二者可能與卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過體外細(xì)胞的黏附實驗和裸鼠動物模型的研究，闡明MSLN 在 CA125 在這一過程的作用，為理解卵巢癌轉(zhuǎn)移方式提供理論依據(jù)，并可為開發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥提供新的思路和藥物作用靶。 預(yù)期研究結(jié)果： 1． 本課題經(jīng)過 3 年左右的研究，將對 MSLN 在卵巢癌診斷（含早期診斷 ）和病情監(jiān)測的價值基本得出結(jié)論，如結(jié)論是肯定的，對卵巢癌的臨床實踐有重要的意義。這一成果可達(dá)到國際先進(jìn)水平。 2． 闡明 MSLN 和 CA125 的表達(dá)關(guān)系， MSLN 將可以與 CA125 聯(lián)合用于臨床實踐，使得醫(yī)師更準(zhǔn)確地判斷病情。 3． 完成觀察 MSLN 和 CA125 共同作用對細(xì)胞黏附和癌的轉(zhuǎn)移的影響的研究，將可以深入理解二者的功能，理解癌腹腔轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為開發(fā)新的抗癌藥提供理論依據(jù)。 4． 本課題的完成，將撰寫和投稿國外 SCI 期刊文章 3— 4 篇，國家級期刊 4— 6 篇，申報國家級成果一項，省級成果 2— 3 項 。 五、擬采取的研究方法和技 術(shù)路線 (包括理論分析、計算、實驗方法和步驟及其可行性分析、創(chuàng)新處；研究 工作的總體安排和年度進(jìn)度 ) 擬采取的研究方案 : 1． MSLN 在組織中的表達(dá)分析： 用 RTPCR 和免疫組織化學(xué)的方法分析來自正常卵巢 表面上皮 、卵巢良性上皮性腫瘤和臨床各期的卵巢癌的手術(shù)切除標(biāo)本的 MSLN和 CA125的表達(dá)，觀察 ⑴ MSLN的表達(dá)陽性率和定位； ⑵ MSLN和 CA125 的共表達(dá)狀況； ⑶ 對出現(xiàn) MSLN和 CA125 共表達(dá)的標(biāo)本，用 MSLN和 CA125的抗體雙重標(biāo)記，借助免疫熒光技術(shù)用激光共聚焦顯微鏡，分析二者在細(xì)胞的定位是否重疊，即 形態(tài)學(xué)上尋找 MSLN和 CA125結(jié)合的證據(jù)。 2． MSLN 的血清學(xué)和腹水檢測：用 ELISA 法檢測來自 健康婦女和與 1 項中同源的卵巢良性上皮性腫瘤和臨床各期的卵巢癌患者血清中的 MSLN，⑴由健康婦女來源的數(shù)據(jù)確定 MSLN 的正常值范圍，以 此作為基線觀察腫瘤患者血清中 MSLN的水平；⑵分析 MSLN的水平與臨床分期和組織學(xué)分類的關(guān)系；⑶觀察手術(shù)切除腫瘤前后和化療后 MSLN的變化、腫瘤復(fù)發(fā)時 MSLN的值的改變；⑷對上述人群同時監(jiān)測血清 CA125的水平，與組織細(xì)胞的 MSLN和 CA125的表達(dá)狀況相聯(lián)系，觀察 MSLN的過度表 達(dá)是否會影響癌組織 CA125的釋放和血清 CA125的水平；⑸檢測腹水中 MSLN和 CA125的水平， 并與血清的濃度比較，結(jié)合組織細(xì)胞的表達(dá)狀況，分析 MSLN 的釋放和循環(huán)規(guī)律。 在總結(jié)上述 1 和 2 項的基礎(chǔ)上，最終總結(jié) MSLN 是否可作為卵巢癌早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病情監(jiān)測標(biāo)記物， MSLN 是否可以和 CA125 互補應(yīng)用于臨床理解和判斷卵巢癌疾病狀況。 3． 卵巢癌細(xì)胞系的 MSLN 分析：以陽性表達(dá) MSLN 的卵巢上皮性囊腺癌細(xì)胞 OVCAR3 為對照，檢測卵巢漿液性囊腺癌（ SKOV3）、黏液性囊腺癌（ 3AO）、透明細(xì)胞癌（ TOV21G） 3 株細(xì)胞系中的MSLN 和 CA125 的表達(dá)和定位。同時分析培養(yǎng)液中 MSLN 和 CA125 的水平。用雙重?zé)晒鈽?biāo)記借助共聚焦顯微鏡觀察 MSLN 和 CA125 的定位和共表達(dá)情況。 4． MSLN 和 CA125 對卵巢癌細(xì)胞生長和增殖的影戲：用 MSLN 和 CA125 的反義寡聚核苷酸或 RNA干擾技術(shù)（ RNA interference, RNAi）降調(diào)卵巢癌細(xì)胞系中 MSLN 和 CA125 的表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)和 Western blot 證實降調(diào)后，將已經(jīng)降調(diào)了 MSLN 和 CA125 的卵巢癌細(xì)胞系作為實驗組，與未處理的卵巢癌細(xì)胞系為對 照，用細(xì)胞克隆形成率、 MTT 法、流式細(xì)胞術(shù)等觀察 MSLN 和 CA125 對卵巢癌細(xì)胞生長、增殖能力和細(xì)胞凋亡的影響。 5． 體外卵巢癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞的黏附實驗：用 MSLN 和 CA125 的反義寡聚核苷酸或 RNA 干擾技術(shù)降調(diào)卵巢癌細(xì)胞系中 MSLN 和 CA125 表達(dá)，將已經(jīng)降調(diào)了 MSLN 和 CA125 的卵巢癌細(xì)胞系作為實驗組，與未處理的卵巢癌細(xì)胞系為對照，進(jìn)行黏附實驗。手術(shù)中取人卵巢癌患者的腹水，分離得到腹水中腹膜間皮細(xì)胞，體外原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，將間皮細(xì)胞加入培養(yǎng)板的孔內(nèi)；用 51Cr標(biāo)記 4 株卵巢癌細(xì)胞系，將標(biāo)記后的細(xì)胞系 置于包被了間皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)， 37OC 培養(yǎng) 30 分鐘，細(xì)胞黏附在此間發(fā)生，用 γ記數(shù)器探測放射活性，計算細(xì)胞的黏附率。該實驗探討 MSLN 及其可能的受體 CA125在卵巢癌細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞黏附過程中的作用。 6． 異型細(xì)胞黏附實驗：由于至今尚無人 MSLN 的封閉抗體，所以本課題應(yīng)用異型細(xì)胞黏附實驗觀察同時表達(dá) MSLN 和 CA125 的人卵巢癌細(xì)胞與表達(dá) MSLN 的鼠內(nèi)皮樣細(xì)胞 LO 的黏附率，并用針對鼠MSLN 的封閉抗體 B35 封閉 LO 細(xì)胞后，觀察異型細(xì)胞的黏附率的變化。該實驗進(jìn)一步分析 MSLN和 CA125 在細(xì)胞黏附過程中的作用。 7． 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：將 OVCAR3 細(xì)胞以 10 106/個濃度注入雌裸鼠的腹腔，建立卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型， 5 周后記數(shù)腹腔轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。此為對照組。用 MSLN 的反義寡聚核苷酸或 RNA 干擾技術(shù)（ RNA interference, RNAi）分別降調(diào) MSLN 和 CA125 蛋白質(zhì)的表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)量后，將已被降調(diào)了 MSLN 和 CA125 的 OVCAR3 細(xì)胞分別注入雌裸鼠的腹腔（ 10 106/個）， 5 周后將兩個實驗組與對照組比較，記數(shù)實驗組腹腔轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。該實驗在體內(nèi)實驗的基礎(chǔ)上探討 MSLN 和 CA125 對卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移形成的作用。 可行性分析 ： 1． 我們課題組多年從事卵巢癌的基礎(chǔ)研究，主要集中在卵巢癌的早診和癌的侵襲轉(zhuǎn)移等方面。 20xx年，申請人采用高通量的基因芯片技術(shù)，用含人 8000 條基因的 DNA 微陣列分析了卵巢癌的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了 56 條上調(diào)和 23 條下調(diào)的基因， 79 條表達(dá)差異的基因中，其中，間皮素（ mesothelin, MSLN）的變化最為顯著，位于 79 條基因之首，在卵巢癌中顯著上調(diào)表達(dá)。隨后，對用于 DNA 微陣列的標(biāo)本，我們用半定量 RTPCR 和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行了 MSLN 的表 達(dá)檢測，初步驗證了符合芯片雜交的結(jié)果。我們的前期工作使得我們避免了選題上的盲目性，也為課題達(dá)到預(yù)期的研究目標(biāo)打下了客觀的基礎(chǔ)。 2． 由于目前尚無 MSLN 的特異封閉抗體，故本研究擬用 RNAi 和反義寡聚核苷酸技術(shù)降調(diào) MSLN。短的雙鏈 RNA 可特異性的降調(diào)或消除與其序列同源的基因的表達(dá)，可下調(diào)相應(yīng)功能蛋白質(zhì)的表達(dá)，這一現(xiàn)象被成為 RNA interference 或 RNAi。具體應(yīng)用中用仔細(xì)設(shè)計的 21 個堿基的雙鏈 RNA，借助轉(zhuǎn)染方式被導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)，可失活與其任一鏈序列同源的基因的功能，與其他降調(diào)基因技術(shù)（如反義核酸等） 相比降調(diào)高效。申請人 20xx 年在英國 ICRF（帝國癌癥基金，現(xiàn) Cancer Research UK）工作時多次使用該技術(shù)，使得本課題應(yīng)用這一新技術(shù)得到保證。 3． 申請人于 20xx 年在英國 ICRF 參研“腫瘤細(xì)胞中整合素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解作用與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移”（至今英國 ICRF 的研究者未完成該項目）中部分內(nèi)容，曾長期使用激光共聚焦顯微鏡觀察活的瘤細(xì)胞膜的蛋白水解的動態(tài)過程，因此，具有熟練應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的能力。 4． 醫(yī)院是省腫瘤防治中心，申請人所在的婦科是省婦科腫瘤醫(yī)療、教學(xué)和科研重要基地，是醫(yī)科大學(xué)首個培養(yǎng)婦科腫 瘤專業(yè)博士研究生教學(xué)點。每年住院手術(shù)治療的婦科腫瘤患者達(dá) 3000 多例，其中，卵巢腫瘤患者約 1000 多例。對所有治療的病例，病案資料齊全，對惡性腫瘤患者，有專人登記和隨訪。因此，我們有充足的研究所需的標(biāo)本和病例資料，使進(jìn)行此項研究得到保證。 5． 腫瘤研究所、省腫瘤研究重點實驗室均附設(shè)在醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院，有較好的開展分子生物學(xué)、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)等研究的條件，擁有超低溫冰箱、實時定量 PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、 γ 記數(shù)儀、激光共聚焦顯微鏡（醫(yī)科大學(xué)藥理教研室）、 DNA 測序儀、動物中心等開展此項目的必備設(shè)備和條件。主要申請人有腫瘤 學(xué)、病理學(xué)、癌的侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等豐富的研究經(jīng)驗，故申請單位有充足信心和能力完成并達(dá)到預(yù)期研究目的。 本項目的特色與創(chuàng)新之處： 1． MSLN 的基因在人體卵巢癌組織中上調(diào)表達(dá)的研究報道，僅有 20xx 年 8 月的美國一篇報道，與我們用基因芯片篩查的研究同步，但美國學(xué)者沒有對該指標(biāo)進(jìn)行后期的驗證工作，而這一步分析是芯片雜交結(jié)果的必需部分。我們不僅發(fā)現(xiàn)了 MSLN 基因在卵巢癌組織中的上調(diào)顯著，還在基因和蛋白質(zhì)水平驗證了芯片的結(jié)果。截止到本申請撰寫時，國內(nèi)未見 MSLN 的研究報道。本課題的選題具新穎 性。 2． 本組在 MSLN 的臨床應(yīng)用價值方面率先開始系統(tǒng)的研究。 MSLN 用于卵巢癌診斷指標(biāo)的研究也僅有一項美國的研究報道，且尚未完成。國內(nèi)未見相關(guān)報道。 3． CA125 已經(jīng)長期應(yīng)用于臨床實踐，根據(jù) 20xx 年 12 月的最新的研究報道啟示，在本研究中我們將MSLN 的表達(dá)與 CA125 的表達(dá)相聯(lián)系，試圖發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在聯(lián)系，如能達(dá)到預(yù)期的目的，不僅為臨床實踐提供價值很高的參數(shù)，也將為研究 MSLN 和 CA125 的功能開辟新的途徑。 4． 本研究根據(jù)最新的實驗研究結(jié)果和合理地科學(xué)推測，設(shè)計進(jìn)行 MSLN 和 CA125 對卵巢癌細(xì)胞黏附的影響的實驗研究 ，尤其是結(jié)合卵巢癌的獨特轉(zhuǎn)移規(guī)律，研究 MSLN 和 CA125 對卵巢癌細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞（表達(dá) MSLN）的黏附的影響，在此基礎(chǔ)上擬建立動物模型觀察 MSLN 和 CA125 在體內(nèi)對卵巢癌轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果將對理解癌腹腔轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和開發(fā)新的抗癌藥提供理論依據(jù)，這一思路在國內(nèi)外均未見報道