【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 完成功能微生物功能的進(jìn)一篩選，獲取更為穩(wěn)定的優(yōu)化菌株，并取得階段性成果； 完成產(chǎn)品的中試工作，獲取相應(yīng)的技術(shù)參數(shù)和產(chǎn)品樣品； 完成了樣品的大田試驗(yàn)，并取得相應(yīng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)； 完成多次的中試調(diào)整 ，已獲取最佳的產(chǎn)品參數(shù)和工藝指標(biāo)，完成產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)路線和條件； 完成了產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的設(shè)備選型，已達(dá)成和簽定了幾家設(shè)備供應(yīng)協(xié)議；完成項(xiàng)目建設(shè)用土的征用和場(chǎng)地的三通一平工作，并通過(guò)投標(biāo)方式確定施工隊(duì)伍，現(xiàn)已進(jìn)場(chǎng)開(kāi)始基礎(chǔ)設(shè)施的施工。 （二）項(xiàng)目主要內(nèi)容 1）關(guān)鍵技術(shù) 15 A)多功能載體生物基材料的形成，是項(xiàng)目的基礎(chǔ)； 由于該材料占產(chǎn)品的 80%以上的含量，所以它的成本決定了本項(xiàng)目產(chǎn)品的最終價(jià)格，也是決定了本產(chǎn)品的最終市場(chǎng)接受程度，因此，原料必需來(lái)源廣泛的有機(jī)廢棄物，這就對(duì)載體物質(zhì)的技術(shù)要求更高、更復(fù)雜； 本基質(zhì)材料必 須具備承載多種活體功能微生物的條件要求，不含有影響功能菌生存的抗生素等物質(zhì)、不含有排他性微生物代謝產(chǎn)物。基質(zhì)材料不得影響功能微生物的生存和功效的發(fā)揮。因此，要求原料的降解過(guò)程是受控的，最終的產(chǎn)物是人為要求的，也就要使生物基材料達(dá)到工業(yè)發(fā)酵的結(jié)果；必須滿足功能菌正常生存的物理化學(xué)條件，如一定的 C/N，一定的營(yíng)養(yǎng)結(jié)果，一定的顆粒空間（即溶氧程度），一定的自由水 /束縛水比例等條件要求。所以要求代謝過(guò)程的可控性； 該載體中必需含有一定含量、一定結(jié)構(gòu)的多糖物質(zhì)，多糖物質(zhì)的存在主要為功能微生物對(duì)無(wú)機(jī)養(yǎng)分的控釋，提供必要 的絡(luò)合物載體，為功能微生物實(shí)現(xiàn)控釋提供條件。因此，產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵工藝技術(shù)提出了更高的要求。 為解決以上三個(gè)技術(shù)難題，我們?cè)谔幚砩镌从袡C(jī)廢棄物發(fā)酵菌的培養(yǎng)上，采用了福建農(nóng)林大學(xué)的發(fā)明專利技術(shù)（專利號(hào)： ZL ）； 發(fā)明創(chuàng)造名稱：粉虱座殼孢菌孢子萌發(fā)培養(yǎng)基）。通過(guò)該技術(shù)培養(yǎng)出的發(fā)酵菌可達(dá)到高含菌量、高萌發(fā)率的目的。使得發(fā)酵菌在處理有機(jī)物時(shí)，能實(shí)現(xiàn)微生物菌在短時(shí)間內(nèi)對(duì)物料的完全覆蓋，占領(lǐng)物料的所有生態(tài)空間，取得完全生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，達(dá)到人工接種和工業(yè)化發(fā)酵的條件。 B) 防蟲(chóng)抗病菌功能的穩(wěn)定表達(dá) 防蟲(chóng)抗病的功能微生物菌我們采用了淡紫擬青霉菌，該菌株來(lái)源于我司與廈門大學(xué)生命科學(xué)院聯(lián)合開(kāi)發(fā)選育的菌株（見(jiàn)“聯(lián)合開(kāi)發(fā)合同書”），該菌株能否在載體材料上得到有效的表達(dá)是本項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵。 16 本項(xiàng)目通過(guò)對(duì)生產(chǎn)條件、工藝參數(shù)改變和優(yōu)化，首先使最終發(fā)酵后的產(chǎn)成品中分生孢子數(shù)量更多，增加對(duì)線蟲(chóng)的侵染機(jī)率。 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)條件的改變使菌株遺傳更加穩(wěn)定，活性更強(qiáng)，有利孢子的萌發(fā)和對(duì)線蟲(chóng)的侵染。 C) 控釋功能菌的選育 本菌株來(lái)源于我司與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)廠共同選育菌株，通過(guò)對(duì)母菌株的基因誘變，選育出具有穩(wěn)定性能，新突變菌株。培 養(yǎng)出具有穩(wěn)定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢多糖莢膜，這種多糖莢膜物質(zhì)它能與游離的NH4+ P5+、 K1+形成絡(luò)合物或螯合物，如下結(jié)構(gòu)： [ CH—— CH2—— CH ] n ︱ ︱ OH OH OH + [NH4 ] 1+ +H2O+｛ CH｝ n NH4（ H2O） NH4(H2O) O H O H [ CH—— CH2—— CH ] n 5+ 17 ︱ H H ︱ CH — O O — CH P5+ +〔 CH〕 n ︱ H P ︱ CH — O O — C H ∣ H ∣ OH +1 K+ +〔 CH〕 n K﹙ CH2OH﹚ n 由于這些絡(luò)合物、螯合物的形成過(guò)程是可逆性的，其可逆性的原理隨周圍的 N P5+、 K1+的含量（濃度）減少而逐步釋放出被絡(luò)合、螯合的（ NH4） +、P5+、 K1+。從而達(dá)到對(duì) N、 P2O K2O的控釋作用，其釋放的速率及被作物吸收的情況通過(guò)同位數(shù)化學(xué)分子跟蹤法進(jìn)行檢測(cè)，其數(shù)據(jù)證明，釋放的速率同步于作物吸肥速率。其次通過(guò)特殊的選擇性培養(yǎng)基工藝，篩選出與載體材料和淡紫擬青霉菌相親和的菌株，實(shí)現(xiàn)功能的穩(wěn)定發(fā)揮。 2) 創(chuàng)新點(diǎn)體現(xiàn) A) 用專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)載體的創(chuàng)新 在解決有機(jī)物的生物代謝途徑，我們采用了福建農(nóng)林大學(xué)的發(fā)明專利（專利號(hào)： ZL ；發(fā)明創(chuàng)造名稱：粉虱座殼孢菌孢子萌發(fā)培養(yǎng)基），來(lái)培養(yǎng)里 氏木霉 (Trichoderma reesei)、 擬康氏木霉 （ Trichoderma pseudokoning??） 兩種微生物發(fā)酵菌。采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的這兩種微生 18 物，從菌體形態(tài)和菌體數(shù)量（ 菌絲層厚而稠密 ） 來(lái)看明顯優(yōu)于一般培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)（如圖 02） 。 圖 02 在顯微鏡（ 1040 視野）下觀察的擬康氏木霉發(fā)酵終點(diǎn)的培養(yǎng)物 比較 Compare to the fermented liquid of Trichoderma pseudokoning?? observed in the microscope ⑴ 從鏡面和平板計(jì)數(shù)的結(jié)果表明 專利技術(shù)培養(yǎng)基含菌量要數(shù)倍于一般培養(yǎng)基，這為我們用于定向降解有機(jī)廢棄物獲取目標(biāo)產(chǎn)物提供重要的基礎(chǔ)條件。 ⑵ 從發(fā)酵有機(jī)廢棄物的結(jié)果產(chǎn)物來(lái)分析：①、主要的產(chǎn)物是低分子多糖、 吡咯并哌嗪 2， 5二酮（ cI）、 3甲基 哌嗪 2， 5二酮 (cII)、 3羥甲基 8羥基吡咯并哌嗪 2， 5二酮（ cIII）、胸腺嘧啶（ cIV）、 3異丁基6另丁基 哌嗪 2， 5二酮 (cV)、 3異丁基 吡咯并哌嗪 2， 5二酮 (cVI)、色氨酸（ cVII）、 maricyclocin（ cVIII）（ 如 圖 03） 。 19 多 糖分子結(jié)構(gòu) HNNOO HNNHOO HNNOOOHHOH2C HNNHOO cI cII cIII cIV HNNHOO HNNOO NHCH2 CHCOOHNH2 cV cVI cVII H NNN HH NOOOO HO 圖 03 分子結(jié)構(gòu)圖 ②、產(chǎn)物的提取物含量經(jīng) Polyamide SC 柱層析 （如圖 04） 20 圖 04 發(fā)酵產(chǎn)物 提 取 物經(jīng) Polyamide SC 柱層析的甲醇洗脫組分 (A， B， C)與 低分子多糖 (D， E， F)的 LCESIMS 圖譜 ⑶ 從圖譜分析比較來(lái)看，主要是以低分子多糖成分為主，從分子量來(lái)分析主要以 2～ 13 個(gè)聚合度的分子多糖為主，這為我們提供了絡(luò)合或螯合無(wú)機(jī)化學(xué)養(yǎng)分一個(gè)很好的載體條件。 通過(guò)以上對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物種類和數(shù)量的分析，我們采用的福建農(nóng)林大學(xué)的培 21 養(yǎng)基發(fā)明專利，培養(yǎng)出來(lái)的微生物發(fā)酵菌，來(lái)處理有機(jī)廢棄物所獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，不但沒(méi)有存在任何的抑菌物質(zhì)，而且還含有豐富的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一個(gè)理想的微生物承載載體。表 05 為兩種 載體的成分比較： 表 05 兩種載體成分的對(duì)比： 一般有機(jī)物載體 專利技術(shù)的有機(jī)載體 硫 化 氫 （ H2S）、 甲 硫 醇（ CH3SH）、二甲基硫（ CH3）2S、 二甲氧基雜色曲菌素 B (aIV) 、 對(duì) 芐 氧 基 苯 酚（ aV）、酪氨酸（ aVI）、麥角甾－ 5， 7， 22－三烯－ 3(－醇 (aVII)、 5(, 8(－表二氧麥角甾－ 6, 22－二烯－3(－醇 (aVIII)、丁二酸(aIX)、尿素 (aX)、尿嘧啶(aXI)、甘露醇（ aXII）。其中 6－甲氧基柄曲菌素（ aII）， 6－二甲氧基雜色曲菌素 B (aIV)、對(duì)芐氧基苯酚（ aV） 低分子多糖、 吡咯并哌嗪 2，5二酮（ cI）、 3甲基 哌嗪 2，5二酮 (cII)、 3羥甲基 8羥基 吡 咯 并 哌嗪 2， 5二酮（ cIII）、胸腺嘧啶（ cIV）、3異丁基 6另丁基 哌嗪 2，5二酮 (cV)、 3異丁基 吡咯并哌嗪 2， 5二酮 (cVI)、色氨酸（ cVII）、 maricyclocin（ cVIII） 該載體的形成將為生物肥料及其功能性生物肥料的發(fā)展打開(kāi)了技術(shù)瓶頸。 B) 生產(chǎn)工藝技術(shù)的創(chuàng)新 ① 引入營(yíng)養(yǎng)物流加工藝 流加工藝可改變 發(fā)酵后期的營(yíng)養(yǎng)條件，有利菌體性能的穩(wěn)定，有利于產(chǎn)生的分生孢子