g418篩選和單克隆挑取(編輯修改稿)
2024-09-26 09:49 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 蛋白質(zhì)的合成而殺死細胞的。但是新霉素對真核細胞無作用而 G418 對細菌和真核細胞都起作用。 neo 就是編碼 3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素和 G418。在進行轉(zhuǎn)染時細胞膜 受到影響，抗生素可能對細胞產(chǎn)生較大影響，加上 G418 有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。 3，匯合度對 G418 篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過 50% 4， G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定 G418 的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到 1000 個細胞 /ml，在 100ug/ml~1mg/ml的 G418 濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在 10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低 G418 濃度來進行下一步的篩選試驗。一個具體試驗：3*106 個細胞電轉(zhuǎn)后，分別接種 1/4000， 1/1000， 1/300 細胞到 24 孔板中， 48h后加藥篩選，此時 1/300 細胞孔內(nèi)大約 50%匯合度。理論上 1/4000孔內(nèi)應有 4%的匯合度。篩選 9 天后，觀察 1/4000 孔內(nèi)有兩三個 克隆 ，按比例 1/300 孔內(nèi)應該有幾十個 克隆 ，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個 克隆 。 加藥時間和維持濃度 1，由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染 24 小時之后才開始加G418 篩選。隨著細胞的代謝 G418 的濃度和活性都回下降，所以每 3~5 天都要更換一次含有 G418 的篩選液。這時藥物濃度可以降至 200ug/ml。 2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞 基因組 的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉(zhuǎn)染 48 小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的 1/2。 關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。 篩選時的培養(yǎng)液 加藥篩選約 6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現(xiàn)兩個問題：1， 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有 neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液 2 ，孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液 ：假如你要轉(zhuǎn)染 3T3 細胞，在 3T3細胞匯合度達到 80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按 1： 1 混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應用這種培養(yǎng)基。 3，適當增加血清濃度。 篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法： 1， 問題 1。做 hela 細胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選 3 周，在 6 孔板中已經(jīng)長出一些細胞簇，想把它挑到 96 孔板中，就用 2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去 了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用 37 度溫箱預熱，并且 PBS 潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響； b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到 37度溫箱中繼續(xù)作用 1MIN，這時，消
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