【文章內(nèi)容簡介】 nce liquid chromatography 和 Chiral gas chromatography ， Chiral HPLC 和 Chiral GC）、核磁共振（ NMR）、單晶 X衍射（ XRSD）以及旋光色散（ Optical rotatory dispersion， ORD）、圓二色譜（ Circular dichroism， CD）等 。 其中單晶 X衍射為直接方法，可提供最直接的信息。也可采用間接的方法，如：在說明化合物（藥物）在反應(yīng)過程中構(gòu)型沒有變化的情況下，根據(jù)已知的起始原料構(gòu)型、化學(xué)合成方法的立體選擇性以及中間體的結(jié)構(gòu)也可間接獲得終產(chǎn)品（藥物）的構(gòu)型信息。 藥物分子中含有多個不對稱因素 應(yīng)對其絕對構(gòu)型、對映體純度（非對映體純度） 進(jìn)行相關(guān)的研究，并盡可能提供更多的構(gòu)型確證信息。 立體異構(gòu)混合物 需進(jìn)行 各立體異構(gòu)體比例的確證研究。對于已有實驗證據(jù)或文獻(xiàn)報道立體異構(gòu)體在藥效、 藥 代 動力學(xué) 或毒理等方面有明顯不同或有相互作用的藥物，更有必要 測定 混合物中各組分的構(gòu)型和比例。 外消旋 體 或富集對映體 可通過 測定旋光度 或 采用 手性色譜（ Chiral HPLC 或 Chiral GC）及核磁共振譜 等 方法 闡明其對映體的比例 。 不含金屬元素的有機(jī)鹽類或復(fù)合物 根據(jù)結(jié)構(gòu)確證的需要，可提供成鹽前后的兩套波譜和試驗數(shù)據(jù)。 對 于某 些波譜測定有困難或不易說明藥物結(jié)構(gòu)的鹽或復(fù)合物，測定藥物的酸根或堿基的波譜，并結(jié)合其它試驗項目亦可對其結(jié)構(gòu)確證提供有效的信息。 金屬鹽類和絡(luò)合物 在進(jìn)行一般要求的各項測試基礎(chǔ)上，考慮以適當(dāng)手段反映藥物中金屬元素14 的種類、存在形式和含量的確證試驗 。 不適于或不能測試金屬鹽本身的項目，可考慮以成鹽前的酸分子或配位體的相應(yīng)測試結(jié)果進(jìn)行佐證。 半合成藥物 分子中母核的結(jié)構(gòu)為已知并在可提供明確證據(jù)證明原分子母核結(jié)構(gòu)在半合成全過程中未發(fā)生改變的前提下，適當(dāng)簡化對母核部分結(jié)構(gòu)的確證工作，僅對新引入的基團(tuán)結(jié) 構(gòu)進(jìn)行確證。 多晶型藥物 在進(jìn)行一般要求的各項測試基礎(chǔ)上，應(yīng)以 適當(dāng) 方法獲得藥物晶型數(shù)據(jù)。藥物晶型測定常用方法為粉末 X衍射（ XRPD）、紅外吸收光譜、熔點、熱分析、光學(xué)顯微鏡等。 該類藥物一般可分為以下幾種情況： 新化學(xué)實體的 藥物 應(yīng)進(jìn)行 藥物在不同結(jié)晶條件下（溶劑、溫度、結(jié)晶速度等）是否存在多種晶型的研究。 已有文獻(xiàn) 報道 存在多晶型的藥物 應(yīng)明確藥物 晶型的類型 和 純度 。對于混晶藥物 ，應(yīng) 測試其晶型組成（種類、比例） ，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較。 對于因晶型影響藥物的溶解性、穩(wěn)定性、生 物利用度和活性的藥物，在無相應(yīng)藥理 毒理 等研究證明該晶型的安全和有效性時， 應(yīng)確證 自制品與國外上市 藥品 晶型 的一致 性。 含有結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑的藥物 該類藥物在進(jìn)行一般分析時，熱分析研究已經(jīng)提供了藥物中的結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑的信息，結(jié)合干燥失重、水分或單晶 X衍射（ XRSD）等方法的測定結(jié)果，基本上可以達(dá)到對藥物中結(jié)晶水 /溶劑以及吸附水 /溶劑進(jìn)行定性、定量的目的。 15 合成多肽藥物和多糖類藥物 合成多肽藥物 通過 氨基酸分析、質(zhì)譜測定、序列分析以及肽圖測繪（含有 20 個以上的氨基酸殘基藥物） 等實驗可基本獲得合成多肽藥物的結(jié)構(gòu)信息。藥物結(jié)構(gòu)中如有半胱氨酸，應(yīng)明確其狀態(tài)（氧化態(tài)或還原態(tài)），對含有多個半胱氨酸的多肽藥物， 應(yīng) 明確二硫鍵 的 正確連接位點 。 如各步中間體均進(jìn)行了質(zhì)譜測定，可 根據(jù)相關(guān)中間體的結(jié)構(gòu)信息， 推測出進(jìn)行反應(yīng)的氨基酸的種類。 質(zhì)譜是多肽藥物結(jié)構(gòu)確證的重要手段，紫外 、 紅外 、 核磁共振 、 多種流動相 HPLC、 比旋度測定等 方法亦可對肽的結(jié)構(gòu)確證提供幫助 。 對于多肽藥物， 應(yīng)對 目標(biāo)物的化學(xué)純度和對映體或非對映體純度 進(jìn)行 研究 。 多糖類藥物 通過對單糖組成、分子量、糖苷鍵連接方法 和 連接位置等的分析，可獲得多糖類藥物的 基本 結(jié)構(gòu) 信息 。單糖 的 分離和鑒定可采用紙色譜、薄層色譜、高效液相色譜、 色 －質(zhì)聯(lián)用 等 技術(shù) 。 多糖的相對分子量及分子量分布測定 可 用凝膠色譜等方法 。 紅外光譜、核磁共振、化學(xué)反應(yīng)后產(chǎn)物的分析等實驗，可幫助確定糖苷鍵的連接方式及糖苷鍵的位置。 多組份藥物 應(yīng)明確各組份的組成比例， 對其 主要成分應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，具體方法可參照本指導(dǎo)原則的相關(guān)要求。 其它 上述未提及的具有特殊結(jié)構(gòu)，需特殊方法進(jìn)行說明、確證的藥物，可根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，制訂能反映藥物自身結(jié)構(gòu)特征的方法進(jìn)行 結(jié)構(gòu)研究。 測試樣品的要求 在結(jié)構(gòu)確證的研究中， 測試 樣品的純度需要進(jìn)行一定的控制，只有使用符合要求的 測試 品進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，才能獲得藥物正確的結(jié)構(gòu)信息 。 一般情況下 ，應(yīng) 采用原料藥制備工藝中產(chǎn)品的精制方法對樣品進(jìn)行精制，16 并采用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的方法測其純度 和 雜質(zhì)，供試樣品的純度應(yīng)大于 %，雜質(zhì)含量應(yīng)小于 %。 結(jié)構(gòu)確證研究的一般內(nèi)容 一般藥物的結(jié)構(gòu)確證 藥物元素組成 通常采用元素分析法 。 這種方法可獲得組成藥物的元素種類及含量， 經(jīng) 比較測試結(jié)果與理論結(jié)果差值的大小（一般要求誤差不 超過 ％），即可初步判定供試品與目標(biāo)物的分子組成是否一致。 對于因藥物自身結(jié)構(gòu)特征而難于進(jìn)行元素分析時，在保證高純度情況下可采用高分辨質(zhì)譜方法獲得藥物元素組成的相關(guān)信息。 紫外吸收光譜（ UV） 通過對藥物溶液在可見 紫外區(qū)域內(nèi)在不同波長處吸收度的測定和吸收系數(shù)（尤其是摩爾吸收系數(shù)）的計算，以及對主要吸收譜帶進(jìn)行歸屬（如 K 帶、 R 帶、 E 帶、 B 帶），可獲得藥物結(jié)構(gòu)中可能含有的發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)種類以及初步的連接方式等信息，同時對藥物的鑒別亦有指導(dǎo)意義。 對于發(fā)色團(tuán)上存在酸性或堿性基團(tuán)的藥物，通過在 酸或堿溶液中（常用） 最大吸收波長的測試，觀察其紫移或紅移現(xiàn)象，可為上述酸性或堿性基團(tuán)的存在提供進(jìn)一步的支持。 紅外吸收光譜（ IR） 通過對藥物進(jìn)行紅外吸收光譜測試，可推測出藥物中可能存在的化學(xué)鍵、所含的官能團(tuán)及其初步的連接方式， 亦 可給出藥物的幾何構(gòu)型、晶型、立體構(gòu)象等信息。 固態(tài)藥物紅外測試可分為壓片法、糊法、薄膜法，液態(tài)藥物可采用液膜法測試，氣態(tài)藥物則可采用氣體池測定。 部分含多晶型藥物在研磨和壓片過程中，其晶型可能發(fā)生變化，可改用糊17 法測 定 ，同時 應(yīng)根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)特點對糊劑的種類進(jìn)行選擇。鹽酸鹽藥物在采用 KBr 壓片時可能會發(fā)生離子交換現(xiàn)象，應(yīng)分別對氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法測得的結(jié)果進(jìn)行比較，并根據(jù)結(jié)果選擇適宜的壓片基質(zhì)。 核磁共振（ NMR） 本項測試可獲得藥物組成的某些元素在分子中的類型、數(shù)目、相互連接方式、周圍化學(xué)環(huán)境、甚至空間排列等信息，進(jìn)而推測出化合物相應(yīng)官能團(tuán)的連接狀況及其初步的結(jié)構(gòu)。常用的有氫核磁共振譜（ 1HNMR）和碳核磁共振譜（ 13CNMR）等。 核磁共振測試的重要參數(shù)有化學(xué)位移（ δ）、偶合常數(shù)（ J 值）、峰形 、積分面積等。 溶劑峰或部分溶劑中的溶劑化水峰可能會對藥物 結(jié)構(gòu)中 部分信號有干擾，因此 測試時應(yīng) 選擇適宜的溶劑 和 方法 ， 以使藥物所有信號得到充分顯示。 氫核磁共振譜（ 1HNMR） 該項測試可提供供試品 結(jié)構(gòu) 中氫原子的 數(shù)目、周圍化學(xué)環(huán)境、相互間關(guān)系、空間排列等信息。此外 ， 屬于 1HNMR測試的 NOE（ Nuclear Overhauser effect） 或 NOESY 試驗，還可給出某些官能團(tuán)在分子中位置、優(yōu)勢構(gòu)象及構(gòu)型。 對含有活潑氫的藥物必需進(jìn)行氘代實驗，以提供活潑氫的存在以及位置的信息。 碳核磁共振譜（ 13CNMR） 該項測試可提供供試品 結(jié)構(gòu) 中不同碳原子的類型以及所處的不同化學(xué)環(huán)境信息。 DEPT（ Distortionless enhancement by polarization transfer）譜可進(jìn)一步明確區(qū)分碳原子的類型，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物， DEPT 譜對結(jié)構(gòu)解析可給予更加有力的支持。 二維核磁共振譜 常用的二維核磁共振測試包括 HHcosy（ HH 18 Correlated spectroscopy）、 HMBC（ 1Hdetected multiplebond heteronuclear multiplequantum coherence ） 、 HMQC （ 1Hdetected heteronuclear multiplequantum coherence） 等，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜或用一般 NMR 方法難以進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證的化合物，進(jìn)行二維譜測試可更有效地確證藥物的結(jié)構(gòu)。 其它核磁共振譜 分子式中含 F、 P 等元素的藥物，進(jìn)行相應(yīng)的F、 P 譜測試，除可提供相應(yīng)元素的種類、在分子中所處的化學(xué)環(huán)境等信息外，對藥物元素組成測試亦有佐證作用。 質(zhì)譜（ MS） 用于原子量 和 分子量的測定 、 同位素的分析 、 定性或定量的分析，重要參數(shù)有分子離子峰、碎片峰、豐度等。 分子離子峰是確證藥物分子式的有力證據(jù)，應(yīng)根據(jù)藥物自身結(jié)構(gòu)特性選擇適宜的離子源和強(qiáng)度，同時盡可能地獲得分子離子峰和較多的、可反映出藥物結(jié)構(gòu)特征的碎片峰。 對含有同位素元素（如 Cl、 Br 等）的藥物，利用分子離子峰及其相關(guān)峰豐度間的關(guān)系，可以判斷藥物中部分組成元素的種類、數(shù)量。 高分辨質(zhì)譜是通過精確測定分子量確定藥物分子式，但它不能反映藥物的純度和結(jié)晶水、結(jié)晶溶劑、殘留溶劑等情況。 隨著科學(xué)的發(fā)展， 在藥物研究中也采用了 GC－ MS、 MS－ MS、 LC－ MS等方法，研發(fā)者應(yīng)根據(jù)藥物的組成和結(jié)構(gòu)特征選擇適宜的方法。 粉末 X衍射（ XRPD） 可 用于 固態(tài) 單一 化合物的鑒別與晶型確定 ，晶態(tài)與非晶態(tài)物質(zhì)的判斷 ， 多種化合物組成的多 相 （組分）體系中的組分（物相）分析（定性或定量） ， 原料藥（晶型）的穩(wěn)定性研究等。 手性藥物的結(jié)構(gòu)確證 手性藥物的結(jié)構(gòu)（或通過生成其衍生物）確證應(yīng)在上述一般研究的基礎(chǔ)上，19 對其 絕對 構(gòu)型進(jìn)行確證 。 常用方法 有 單晶 X衍射（ XRSD）、核磁共振譜（ NMR）、圓二色譜（ CD）、旋光光譜（ ORD）以及 前 述的 NOESY 或 NOE 譜（主要適用于具有剛性結(jié)構(gòu)的藥物）等。其中單晶 X－衍射（ XRSD）為直接方法，后三種為間接方法。 單晶 X衍射（ XRSD） 可獲得有關(guān)藥物晶型的相關(guān)信息 、 藥物的相對或絕對構(gòu)型以及與藥物以結(jié)晶形式存在的水 /溶劑及含量等一系列信息。 手性藥物絕對構(gòu)型 的測試 ，建議采用單晶 X 射線四園衍射儀， CuKα 靶 ，衍射實驗的 θ 角范圍不低于 57176。 普通的單晶 X衍射不能區(qū)分對映體，僅能推導(dǎo)出在空間的相對 位置和藥物的相對構(gòu)型。 圓二色譜（ CD ） 該項測試通過測定光學(xué)活性物質(zhì)（藥物）在圓偏振光下的 Cotton 效應(yīng)，根據(jù) Cotton 效應(yīng)的符號獲得藥物結(jié)構(gòu)中發(fā)色團(tuán)周圍環(huán)境的立體化學(xué)信息，并與一個絕對構(gòu)型已知的與待測藥物結(jié)構(gòu)相似藥物的 Cotton效應(yīng)相比較，即可能推導(dǎo)出待測物的絕對構(gòu)型。 此外對于一般具有剛性結(jié)構(gòu)的環(huán)體系的羰基藥物，通過比較其 Cotton 效應(yīng)的符號并結(jié)合經(jīng)驗規(guī)律 “八區(qū)律 ”，亦可能預(yù) 測 某些羰基藥物的絕對構(gòu)型。 旋光光譜 通過比較相關(guān)藥物的旋光性，可得到手性藥物的相對構(gòu)型信息。如能得知藥物旋光的可測范圍，則在一系列反應(yīng)后，藥物絕對構(gòu)型可從用于制備該藥物的底物構(gòu)型推導(dǎo)得到。 在采用該方法測定藥物絕對構(gòu)型時，要在相同的溶劑中以相同的濃度和溫度測定旋光，以保證比較的可靠性。 NOESY 或 NOE 譜 通過對具有剛性結(jié)構(gòu)（或優(yōu)勢構(gòu)象）藥物官能團(tuán)上質(zhì)子的選擇性照射，致使與其相關(guān)質(zhì)子峰強(qiáng)度的增減和相互間偶合作用20 的消失，從而推測出鄰近官能團(tuán)的空間構(gòu)象，進(jìn)而可獲得藥物構(gòu)型的信息。 其他方法 例如化學(xué)比較法、核磁共振法等。 藥物晶型的研究 在藥 物研發(fā)過程中，多晶型現(xiàn)象是普遍存在的，其中有部分藥物因晶型不同具有不同的生物利用度和 /或生物活性，特別是水溶性差的口服固體藥物。 對于新化學(xué)實體的 藥物 ，應(yīng) 對 其在 不同結(jié)晶條件下（溶劑、溫度、結(jié)晶速率等） 的 晶型 進(jìn)行研究；通過 不同晶型 對 藥物活性和毒性 等影響的 研究 可為其臨床應(yīng)用晶型的選擇提供依據(jù)。 對于仿制已上市的藥物， 應(yīng)進(jìn)行 自制藥物的晶型與已上市藥物晶型 比較 的研究 ，以保證自制品晶型的正確性 。 進(jìn)行連續(xù)多批樣品晶型一致性的研究，是判斷 藥物制備 工藝是否穩(wěn)定的依據(jù) 之一 。 藥物晶型測定方法通常有粉末 X衍射、紅外光譜、熱 分析、熔點、光學(xué)顯微鏡法等。 粉末 X衍射（ XRPD ） 該項測試是判斷化合物（藥物）晶型的首選方法。 紅外光譜（ IR） 結(jié)構(gòu)相同但晶型不同的藥物其紅外光譜在某些區(qū)域可能存在一定的差異，因此比較藥物的 IR 可以用于區(qū)分藥物的晶型，但應(yīng)注意在研磨、壓片時 可能 會發(fā)生藥物晶型 的 改變。 熔點（ Melt point， mp） 結(jié)構(gòu)相同但不同晶型的藥物其熔點可能存在一定的差異，熔點也可以用于晶型研究。