【文章內(nèi)容簡介】 符合規(guī)范化要求。 薄層鑒別試驗必需注意目的性、針對性、重現(xiàn)性和準確性。供試液的制備不僅要考慮多種藥味所含成分的相互干擾和影響 ，還要考慮到不同工藝和不同劑型各自的特點，譬如一個制劑中含人參同時又含有黃芪，在設(shè)計人參皂甙薄層鑒別時就應(yīng)考慮到黃芪皂甙對它的影響，不論在供試液制備還是展開劑的選擇都要考慮周到。有些藥味所含的甙類成分種類既多，極性又大，經(jīng)多種條件均很難展開分離時，也可考慮用水解后鑒別甙元的辦法。如在多味藥材組成的復方制劑中含人參皂甙的藥材不少，有的品種由于眾多成分的嚴重干擾，鑒別人參皂甙確有困難時，可采用水解后鑒別人參二醇或人參三醇的辦法。但這只能說明在該品種中含有人參皂甙類的成分，不能說明其含何種人參皂甙，所以一般不應(yīng)作 為首選的方法。不同劑型所加添加劑也互不相同，供試液的制備就不可能用同一種方法，如口服液或糖漿劑既是液體制劑，又含有較大量的糖，供試液的制備就不應(yīng)完全照搬不加糖的固體劑型（如片劑），這時萃取方法固然不同，而且除糖也就成為供試液制備要考慮的主要問題。供試液的制備可采用傳統(tǒng)的液液萃取的方法，也可采用固液萃取的方法，而且后者的優(yōu)點更多，也更方便。固液萃取所用的介質(zhì) 中國最大的管理資源中心 第 10 頁 共 24 頁 常見的有硅烷基化硅膠（ C－ 18）小柱、硅膠小柱、氧化鋁小柱、大孔樹脂柱、離子交換樹脂柱、硅藻土小柱等，可以有選擇的使用。 試驗設(shè)計應(yīng)有對照品及對照藥材， 并需作陰性對照（即除去欲鑒別的藥味的 陰性 對服液）。實驗條件應(yīng)有二個以上不同選擇性的展開劑，如均能證明供試品中的欲鑒別成分與對照品的層析行為一致，再從中選取較好的條件列入質(zhì)量標準的正文中．如用對照藥材，要求供試品的色譜與對照品的色譜的主要斑點能一致。因為樣品供試液中還有其他藥味，不可能與單一的藥材的色譜完全一致，因此應(yīng)反復試驗，仔細比較，以便作出準確的判斷。 氣相色譜適宜于制劑中含有揮發(fā)性成分的藥材的鑒別，如冰片、薄荷、麝香（麝香酮），丹皮（丹皮酚），以及以揮發(fā)油為主的藥油類制劑。有的是結(jié)合含量測定項目 進行。如樣品中含有多種揮發(fā)油，需注意色譜的分離度能將各主要組分分開，以免作出模糊的或錯誤的判斷。設(shè)計試驗時，應(yīng)注意制劑的生產(chǎn)工藝，如有的藥材雖然含有揮發(fā)油，但是如果采用的水煮工藝，則揮發(fā)油基本上提取不出來，這就不宜再對成品中該藥材的揮發(fā)油進行鑒別。如以出峰的相對保留時間作為鑒別特征時，必須提供氣相色譜中的該峰的特征參數(shù)，確證無誤，方可成立。 高效液相色譜很少直接用于中藥制劑的鑒別，如果含量測定采用了高效液相色譜法，則可在含量測定項目的進行中考察可否間接地用于定性鑒別。尤其在用其他鑒別手段均無效時，可以考慮 采用。設(shè)計試驗時也同樣要注意色譜條件的優(yōu)化和方法學驗證。 附：薄層色譜規(guī)范化的基本技術(shù)要求 由于中藥材及中藥制劑的鑒別采用薄層色譜法比較普遍，為了提高試驗的重現(xiàn)性及分離度，下列的技術(shù)要求可作為設(shè)計和進行薄層色譜試驗時的參考。 薄層色譜的規(guī)范化技術(shù)要求 ① 儀器與材料 A 薄層板 可用手工自制板或預(yù)制板，用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔，平整，最好使用厚度為 l2mm 的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層極，玻璃板需用洗液或堿液洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用；反復使用時應(yīng)注意需再 用洗液或堿液清洗，如選用預(yù)制板應(yīng)注意生產(chǎn)廠家提供的有關(guān)參數(shù)，挑選，檢查并試用是否符合要求。 最常用的吸附劑通常是加有石膏作粘合劑的商品硅膠 G，或加有熒光劑的硅膠 GF254，有的另加其他粘合劑如羧甲基纖維素鈉以加固薄層板面；為了達到更好的分離的品種要求使用加有酸（如硼酸），堿（加氫氧化鈉）或緩沖溶液等薄層板。不同生產(chǎn)廠家或不同批次的商品硅膠質(zhì)量不可能完全相同，常常會影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性，在重復實驗時尤須注意、硅膠 G 因長期貯放可能使粘合力降低，薄層厚度一般為 250～ 300μm ，有的品種也使用纖維素板、氧化鋁板 或聚酰胺板。 B 涂布器 應(yīng)能使吸附劑在玻璃板上涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。商品有手工、半自動及自動薄層板涂布器。涂布的厚度有固定厚度（如 250μm ）或可以調(diào)節(jié)的兩種。 C 點樣器材： 中國最大的管理資源中心 第 11 頁 共 24 頁 最常用也最方便的是定量點樣毛細管（微升毛細管），規(guī)格有 ， 、 、 、 、 及 10ul 等。對點樣用的微升毛細管的要求是標示容量準確，管端平整光滑，管壁潔凈，液流通暢，無堵塞，無污染，商品最常用的是 Drummond Scientific Co．（美國）的產(chǎn)品，也可選用 色譜用微量注射器（應(yīng)選用針尖平頭適合薄層點樣的）。 為了提高點樣效率，還可選用點樣輔助設(shè)備，如點樣支架，半自動或自動點樣器。選用點樣器材和輔助設(shè)備應(yīng)注意器材本身的質(zhì)量。 D 展開箱（層析缸） 應(yīng)當用薄層色譜專用的展開箱，有平底展開箱和雙槽展開箱，還有一種水平式展開箱。雙槽展開箱具有節(jié)約溶劑、減少污染、便于預(yù)平衡及控制展開條件等優(yōu)點。水平式展開箱可以從薄層板的兩側(cè)向中間展開，展距 5cm（特別是高效薄層板），所以一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行法展開增加了一倍。 用不合格的玻璃器皿如生物標本缸等不能 保證展開的質(zhì)量。 E 顯色與檢測儀器 薄層極展開后，有的需用試劑（顯色劑）顯色。涂布顯色劑有噴霧法和浸漬法。噴霧瓶應(yīng)能在一定壓力下使試劑噴成均勻的細霧狀。薄層掃描定量測定，顯色劑可控制噴灑的數(shù)量和噴霧的壓力。浸漬法用浸漬槽為特制的浸漬槽，將展開后的薄層板平穩(wěn)放入有顯色劑的浸漬槽中數(shù)十秒至 1 分鐘后取出（指凈薄層板背后的殘存試劑）顯色。浸漬槽可用適當?shù)牟Ａ髅蟠妗? 紫外光燈有長波段（ 365nm）和短波段（ 254nm）紫外光管，前者用于觀察具有熒光的色譜，后者一般用于觀察硅膠 GFS254板色譜在薄層板面的 熒光背景下出現(xiàn)的暗藍紫色吸收斑點，選用紫外光燈應(yīng)注意熒光管的功率和濾光片的性能。 薄層掃描儀不僅可以進行原位定量，薄層掃描全圖譜對定性鑒別也能提供有用的信息。 ② 操作方法 A 薄層板的制備 除另有規(guī)定外，將 1 份吸附劑（如硅膠 G）加 3 份左右的水在研缽中用研杵沿一個方向充分研磨，調(diào)成均勻糊狀物，倒入已準備好的涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地以直線方向移動涂布器，使硅膠漿均勻地涂布。須注意的是不同廠家不同批號的硅膠 G 加水量及研磨時間要求有所不同，如加有其他改性劑更是如此。薄層厚度一般為 ～，由于國產(chǎn) 常用的硅膠顆粒大小分布范圍較寬（ 10～ 40μm ），如果顆粒分布不夠均勻，而粗顆占比例較多時，涂布的太薄反而降低分離能力，有的品種，如人參甚至要求用 薄層板。涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在 105～ 110℃ 活化約 30分鐘，置干燥器中備用。使用前應(yīng)在反射光和透射光下檢查板面及紋理是否均勻，如不均勻，有氣泡或有麻點、有破損或已污染（如灰塵、纖維）者應(yīng)棄去不用。 預(yù)制薄層板分常規(guī)薄層板及高效板兩種，由于商品供應(yīng)來源不一，需注意并記錄生產(chǎn)廠家及生產(chǎn)批號，必要時需測定板效，以保證較好的重現(xiàn)性。在質(zhì)量 保證的前提下，應(yīng)盡量選用預(yù)制薄層極，以提高時效和色譜的重現(xiàn)性。 B 點樣 中國最大的管理資源中心 第 12 頁 共 24 頁 除另有規(guī)定外，點樣用的定量微升毛細管（或其他符合要求的點樣工具）按規(guī)定吸取溶液后，以垂直方向小心接觸板面使成圓點狀，點樣基線與底邊的距離，視所用板的大小而定，如采用長度為 10cm 的板，點樣距離底邊以 1cm 為宜，點間距離視情況為 或 2cm，原點直徑應(yīng)不大于 3mm；如樣品容量較大，或為了改善分離度，也可點成寬約 2～ 3mm 不同長度的條帶。點樣時須注意盡量不要損害薄層表面。一般的自制硅膠 G薄層板，板面的牢度不夠，定量測定時需特別注 意小心點樣，不要使原點部分的板面破損。 C 展開 點樣后的薄層板置入加有展開劑的薄層展開箱中，密閉，一般采用上行展開，薄層板浸入展開劑深度一般要求溶劑最初的前沿距原點約 5mm，展開至規(guī)定展開距后立即將薄層權(quán)取出，晾干，以備檢測。多數(shù)品種展距 7～9cm 已夠，少數(shù)需用長度為 15或 20cm 的板；展開可在 10cm 以上。如規(guī)定需用展開劑或其他溶劑的蒸氣預(yù)平衡者可在雙槽展開箱的一側(cè)加入適量的溶劑，如需達到飽和狀態(tài)，可在展開箱內(nèi)壁貼一被溶劑濕潤的濾紙使展開箱易于被蒸氣平衡，如規(guī)定薄層板需要同時預(yù)平衡者，應(yīng)將薄層板放入 箱內(nèi)沒有溶劑的一側(cè)槽中，平衡后再將溶劑傾入此糟中展開。 展開劑要求新鮮配制，如需分層則按規(guī)定要求放置分層后，分取需要的一相（上層或下層）各用。 D 檢測 色譜斑點本身有顏色者可直接在日光下觀察色譜中的色斑，本身在紫外光激發(fā)下可發(fā)射熒光者可直接置紫外光燈下觀察熒光色譜、需加試劑后方能顯色或發(fā)射熒光者，則可將試劑用噴霧器均勻噴灑于薄層板面（或用浸漬法），再按規(guī)定直接觀察或加熱后觀察。浸漬法板面顯色均勻是其優(yōu)點，但有的樣品經(jīng)試劑浸漬后斑點容易被浸潤擴散，則不適用。涂布試劑后如加熱顯色需注意控制加熱溫度和時間 ，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板溫度過高或加熱時間過長易焦化，如用硫酸等試劑則可使板面碳化而影響顯色效果；有的成分加試劑后加熱溫度和加熱時間不同，顯色效果可能有差別、有的品種用蒸氣熏蒸（如碘蒸氣）顯色者，可在密閉器皿中放置適當時間至斑點顯色清晰，薄層色譜還可在薄層掃描儀中進行光密度掃描或熒光掃描。 ③ 影響薄層色譜分析的主要因素 常規(guī)薄層色譜因為是一種 敞開系統(tǒng) 的色譜技術(shù)，與柱色譜的區(qū)別之一是除材料及器材以外，外界環(huán)境條件對被分離物質(zhì)的層析行為影響很大，分離機制也很復雜；操作技巧也明顯的影響色譜質(zhì)量；為了 充分發(fā)揮薄層色譜技術(shù)在中藥分析方面的優(yōu)勢，提高色譜的分離度和重現(xiàn)性，注意控制影響色譜質(zhì)量的因素是非常重要的。以下所述的幾個方面不僅對定量分析是必須注意的問題，對提高定性分析的質(zhì)量也是不可忽視的。 A．樣品的預(yù)處理及供試液的制備 一般認為薄層色譜所用固定相（薄層板）可即用即棄，不怕供試液中雜質(zhì)的污染，因而樣品無需凈化精制。但在實踐中，由于中藥的成分復雜，未知成分多，供試液中溶出的物質(zhì)較多，其中既有欲測成分也有其他 雜質(zhì) 。常常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分高效果，甚至難以辨認，尤其成方制劑更是如 此．所以在許多情況下為了得到一個較為清晰的色譜。樣品提取物經(jīng)預(yù)處理，使供試液得以凈化，往往是一個重要的有時甚至是關(guān)鍵的步驟，制各樣品供試液所用的溶劑一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸點適中；但中藥制劑往往希望將各成分盡量多地提取出來，最常被選用的是甲醇或乙醇，欲測成分和許多其他 雜質(zhì) 均可能被提取出來。因此供試液的凈化就顯得更為必要。 樣品供試液凈化的方法通常有 1．單一溶劑萃取法， 2．分段萃取法； 3．液液萃取法； 4．固液萃取法。 中國最大的管理資源中心 第 13 頁 共 24 頁 B、薄層色譜的點樣技術(shù) 點樣是薄層色譜的第一步，也是關(guān)鍵的一步，它 既關(guān)系到能否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜，也關(guān)系到定量測定結(jié)果的準確與否，因為不良的點樣是測定誤差的最主要的來源。一般在常規(guī)薄層板上原點的直徑不大于 3mm，高效薄層板要求原點直徑不大于 2mm。點樣量不宜過大，最好控制在 10μl 以下，如在一個位置重復多次點樣時，須注意盡量不將原點點成一個空心圈。選用溶劑沸點不宜太高（如正丁醇）或太低（如己醚）。如用乙醚提取，可將最終溶液改用其他非極性溶劑。如用親水性溶劑，或在較高相對濕度環(huán)境下點樣，點樣后應(yīng)將薄層板再干燥（如真空干燥）。點樣時需注意盡量不要損傷薄層板表面。 C、吸 附劑的活性與相對濕度的影響 吸附劑的活性是由吸附劑如硅膠的表面能和表面積決定的。硅膠的硅醇基是親水性基團，很易吸附水分子而成為水合硅醇基而失去活性。自制的硅膠薄層板在 105～ 110℃ 加熱若干時間，就是使水合硅醇基脫水變?yōu)橛坞x硅醇基而活化。反之，活化后的薄層板也可以吸附大氣中的水分子而降低活性。說明硅膠表面吸附水份的作用是可逆的，在日常操作時，當活化后的硅膠（或氧化鋁）薄層板從干燥器中取出，自開始