【正文】 值下降時(shí)，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。計(jì)算公式如下：1625計(jì)數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每個(gè)小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)因?yàn)橛?jì)數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。物鏡在必要時(shí)可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時(shí)要注意下列事項(xiàng)：觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。當(dāng)高倍物鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制射入光線的量，增加明暗差。有些需要很強(qiáng)照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠?。（圖３－１）　　標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。而在食品微生物檢驗(yàn)中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。聚光鏡可以上下移動(dòng)，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。 二、普通顯微鏡的使用方法低倍鏡觀察　　先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對(duì)準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。稍微上下移動(dòng)聚光鏡，觀察圖像是否清晰。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響分辨率。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球?qū)⒍探q吹去。（圖３－２）因?yàn)槊總€(gè)大方格邊長(zhǎng)為1毫米，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室（1個(gè)大方格）　　　圖３－２　兩種血球計(jì)數(shù)板a. 25X16計(jì)數(shù)板 ?！　”竟?jié)包括四部分：一、染色的基本原理　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。三、制片和染色的基本程序　　微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。化學(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。５、脫色　　用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色?！　【C上所述，染色的基本程序如下：　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。２、革蘭氏染色法　　革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制?！　。担┧?，用吸水紙吸去水分。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用?！　。河行┦澄飼?huì)因高溫破壞營(yíng)養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。３）影響滅菌的因素　　。４）滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響　　。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長(zhǎng)。能抑制或阻止微生物生長(zhǎng)繁殖的藥物，稱為防腐劑。新購的玻璃器皿　　除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于１～２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí)，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。由于各類微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測(cè)需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長(zhǎng)緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營(yíng)養(yǎng)、代謝的研究。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。　?。玻┰鲋撑囵B(yǎng)基 在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為了分離我們所需要的微生物，在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。　　某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。1176。１、接種工具和方法　　在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。　?。玻┤c(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。２、無菌操作　　培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。（圖３－６）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。1) 營(yíng)養(yǎng)物濃度 細(xì)菌的生長(zhǎng)率與營(yíng)養(yǎng)物的濃度有關(guān):μ=μmax*C/(K+C) 　　營(yíng)養(yǎng)物濃度與生長(zhǎng)率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。在生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率不一樣。３）水分　　水分是微生物進(jìn)行生長(zhǎng)的必要條件。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長(zhǎng)。分子氧存在對(duì)它們生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣?！　∫后w培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況?！　∥⑸餀z驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：１、糖酵解試驗(yàn)　　不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。２、淀粉水解試驗(yàn)　　某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。1176。1176。1176。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來?！　∮忙凛涟愤M(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽性。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。1硫化氫靛基質(zhì)動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)　　試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36177?！　?)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。１、凝集反應(yīng)　　顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（Agglutination reaction）。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即陽性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。　?。玻╅g接凝集反應(yīng)　　將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)(Indirect agglutination)。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對(duì)應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測(cè)出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。這樣可以使在不同的工廠條件下的樣品取樣更為方便一些。盒子或制冷皿：　　檢驗(yàn)員需要貯藏、運(yùn)輸他們的樣品，如果樣品不需冷凍，那么用一個(gè)盒子即可，但如果樣品需要冷卻，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的制冷皿或保溫箱是必須使用的，一般來講制冷皿隨帶著一個(gè)塑料袋，樣品可以放還袋子里，制冷劑象干冰，等可以放置在袋外，這樣樣品被冰污染的可能性就被避免了?！　‘?dāng)樣品收集時(shí)，樣品采集時(shí)的條件例如產(chǎn)品的溫度、地點(diǎn)等，連同扦樣樣品號(hào)嘜頭，一并記錄入檢驗(yàn)員的注釋說明中，取樣的樣品可以從樣品號(hào)、采集日期、附加樣品號(hào)，最初調(diào)查人和其他鑒別信息事區(qū)分。對(duì)于需要檢驗(yàn)沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件?！　：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。　?。?）二級(jí)抽樣方案。0。下面結(jié)合表1加以說明?！　?duì)食品處理應(yīng)酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌所抑制，不易發(fā)生食物中毒，適用例7和例8。表ICMSF蝦的微生物標(biāo)準(zhǔn)食品名稱檢查項(xiàng)目例級(jí)別nc菌數(shù)限量/gmM冷凍生蝦　　冷凍烹調(diào)蝦細(xì)菌數(shù)大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌細(xì)菌數(shù)大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌1441036912333233325555555533301110106410310210641031021074002103—1074002103—　　（如A1，最大為三位數(shù)），查出所在行的連續(xù)列數(shù)字（如A2所點(diǎn)數(shù)為第48行、第11和12列，其數(shù)字為245），則編號(hào)與該數(shù)相同的那一份單位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。抽樣全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長(zhǎng)能力發(fā)生變化。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。如不能及時(shí)運(yùn)送，冷凍樣品應(yīng)存放在15℃以下冰箱或冷藏庫內(nèi)；冷卻和易腐食品存放在04℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其他食品可放在常溫。四、樣品的標(biāo)記、保存和運(yùn)送：　　抽樣過程中應(yīng)對(duì)所抽樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的標(biāo)記；抽樣結(jié)束后，應(yīng)有抽樣人寫出完整的抽樣報(bào)告，使樣品盡可能保持在原有條件下迅速發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室。常見的抽樣方法有：1．直接食用的小包裝食品：　　盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。該數(shù)字所代表的單位產(chǎn)品為另一件應(yīng)抽取的樣品。隨機(jī)抽樣表系用計(jì)算機(jī)隨機(jī)編制而成，包括一萬個(gè)數(shù)字。加熱鹽腌的火腿，金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例9?！盁o變化”系指微生物數(shù)不增減例如冷凍食品或干燥食品。0。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格?！　：系指附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。在某些情況下用于分析的樣品可能代表所抽“一批”（lot）樣品的真實(shí)情況，這適合于可充分混合的液體，如牛奶和水?！　∵@需要樣品采集人非常小心地采集所有附加樣品，確保不違反這條規(guī)則?！　∪庸ぞ撸骸　　∪庸ぞ甙ǎ翰璩?、角匙、尖嘴鉗、fovceps tongs 量筒和燒杯，工具的類型一般由取樣產(chǎn)品來決定。　　人員的工具設(shè)施，象工作服、發(fā)網(wǎng)或消毒處理過的清潔的鞋靴必須具備有助于證明采集者沒有污染到食物產(chǎn)品或樣品。一個(gè)無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，即：在收集過程中，本身應(yīng)避免污染，然后放入消毒容器中。３、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)　　補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complement fixation reaction)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)?！　。常┉傊瑪U(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對(duì)應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合?！　　Ｔ谠摲磻?yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體?！　?)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。1℃培養(yǎng)1~6天?！　≡囼?yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。否則為陰性。α萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意?！　≡囼?yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36177。C（以30176?！　。常┛焖俜ǎ?肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。亦有主張?jiān)?8~50176。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性?！　≡囼?yàn)方法：以18~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36177?！　≡囼?yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長(zhǎng)?！　『醚跖囵B(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”?！　　　∵@類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長(zhǎng)，只不過所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。微生物是不能脫離水而生存的。超過最低生長(zhǎng)溫度，微生物不會(huì)生長(zhǎng)，溫度太低，甚至?xí)劳?。它的?shù)值很小，表明細(xì)菌所需要的營(yíng)養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到