【正文】 料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色?！　「锾m氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。　　另外，陽性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制?！　。玻┎菟徜@結(jié)晶紫染1分鐘。　?。矗┘拥庖焊采w涂面染1分鐘?！　。叮┘?5%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水分。干燥，鏡檢。滅菌和消毒　　消毒和滅菌兩個(gè)詞在實(shí)際使用中常被混用，其實(shí)它們的含義是有所不同的。一、物理方法溫度　　利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。１）干熱滅菌法:　?。豪没鹧嬷苯影盐⑸餆?。　?。哼@是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160176。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。該法一般在62176。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好?！　。荷鲜鰞煞N方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100176。然后冷卻，放入37176。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。　　d. 加壓蒸汽滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種滅菌方法?！　〖訅赫羝麥缇前汛郎缇奈锲贩旁谝粋€(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達(dá)到121176。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15~20分鐘便會被殺死，而達(dá)到滅菌目的。　　在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個(gè)問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應(yīng)關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在50~65176。C，12分鐘才被殺死。　　，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強(qiáng)，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間長?！　?，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀?！　?。　　?！　。玻?yīng)用β射線作食品表面殺菌，γ射線用于食品內(nèi)部殺菌。３、過濾　　采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時(shí)會給實(shí)驗(yàn)帶來一定的麻煩?！　∧苎杆贇绮≡⑸锏乃幬?，稱為消毒劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細(xì)胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細(xì)胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。培養(yǎng)基制備技術(shù) 一、玻璃器皿的清洗　　在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。有的還要進(jìn)行包裝，經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。二、培養(yǎng)基的類型　　在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型?！　。保┨烊慌囵B(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基?！　。玻┖铣膳囵B(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成?！　。常┌牒铣膳囵B(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多?！　。保┮后w培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。在實(shí)驗(yàn)室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測定等。以瓊脂為例，~1%之間。３、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長等。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基?！　∮行┡囵B(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。它含有膽鹽、乳糖和中性紅?！　×硗?，根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否“完全”，可以分為基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，這類術(shù)語主要是用在微生物遺傳學(xué)中。還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚等；專門用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基等。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。３、培養(yǎng)基成分的稱取　　培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂，最好一次完成，不要中斷。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。５、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正　　因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。因此，對這個(gè)步驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。６、培養(yǎng)基的過濾澄清　　液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求?！　…傊囵B(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。即將冷卻至55~60176。C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。分裝時(shí)最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。８、培養(yǎng)基的滅菌　　一般培養(yǎng)基可采用121176。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。C左右的培養(yǎng)基中。９、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試　　每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去?！　⑷颗囵B(yǎng)基放入36177。C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。放置時(shí)間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)　　一、接種　　將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達(dá)到接種的作用。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。　?。常┐┐探臃N 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時(shí)常采用此法。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基?！　。矗不旖臃N 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45176。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個(gè)的微生物菌落?！　。叮┮后w接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種?！　。福┗铙w接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門窗，并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。（圖３－４）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。　圖３－４　斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、分離純化　　含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。１、傾注平板法　　首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50176。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖３－５，b）３、平板劃線法　　最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖３－７）４、富集培養(yǎng)法　　富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。　　　　圖３－６　平板劃線分離法 ５、厭氧法　　在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下?！　值是細(xì)菌生長的很基本的特性常數(shù)。然而營養(yǎng)太低時(shí)，細(xì)菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這種能量稱為維持能。２）溫度　　在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點(diǎn)：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。微生物只有處于最適生長溫度時(shí)，生長速度才最快，代時(shí)最短。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點(diǎn)是恒定的?！　「鶕?jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類型：　?。浩涫沁m生長溫度多數(shù)在10℃－20℃之間　?。浩渥钸m生長溫度一般在20℃－45℃之間　?。荷L溫度在45℃以上。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。４）氧氣　　按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個(gè)類型。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類型。在無氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用?！　　　∵@類微生物在生長過程中，不需要分子氧。２、培養(yǎng)方法1）根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。就是說這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。這類微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。一般可采用下列幾種方法：　?。撼⑦€原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的?！　。哼@也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧?！　?用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣?！　」藤|(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 １、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。（圖３－８）　圖３－８　細(xì)菌的培養(yǎng)特征 　?。玻┟咕湍妇呐囵B(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重