【正文】 本可用顯微鏡觀察。６、復(fù)染　　脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。染色　　標(biāo)本固定后，滴加染色液。　　以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。固定　　標(biāo)本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：　?。保⑺牢⑸?，固定細胞結(jié)構(gòu)。單純?nèi)玖稀　∵@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色?！　〖毦牡入婞c較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實情況，染色觀察時必須注意。計算公式如下：1625計數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每個小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（2516或1625）400個小方格。因為計數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。轉(zhuǎn)動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉(zhuǎn)動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。物鏡在必要時可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑?！　＄R頭的保護最為重要。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本?！　∈褂糜徒R時，鏡臺要保持水平，防止油流動。當(dāng)高倍物鏡對準標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制射入光線的量，增加明暗差。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。有些需要很強照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠?。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。（圖３－１）　　標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。聚光鏡可以上下移動，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。圖３－１　光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖：　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。 二、普通顯微鏡的使用方法低倍鏡觀察　　先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細調(diào)對準焦距進行觀察。高倍鏡觀察　　顯微鏡的設(shè)計一般是共焦點的。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像是否清晰。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球?qū)⒍探q吹去?！　⊙蛴嫈?shù)器是一只特制載玻片。（圖３－２）因為每個大方格邊長為1毫米，所以每個計數(shù)室（1個大方格）　　　圖３－２　兩種血球計數(shù)板a. 25X16計數(shù)板 。2516計數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)染色技術(shù) 　　由于微生物細胞含有大量水分（一般在8090%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差?！　”竟?jié)包括四部分：一、染色的基本原理　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進行的。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。因此，帶陰電的細菌常和帶陽電的堿性染料進行結(jié)合。 二、染料的種類和選擇　　染料分為天然染料和人工染料兩種。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。堿性染料　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。三、制片和染色的基本程序　　微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。　?。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉?；瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。染色的時間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。５、脫色　　用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進行染色，就是復(fù)染?！　【C上所述，染色的基本程序如下：　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。故亦稱鑒別染色法。在一般情況下，細菌菌體多帶負電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。　　單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。２、革蘭氏染色法　　革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負反應(yīng)。所以染色時的條件要嚴格控制?！　「锾m氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：　　１）涂片固定。　?。担┧?，用吸水紙吸去水分?！　∪旧慕Y(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負反應(yīng)菌體都呈紅色。高溫可使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。C，恒溫1小時即可?！　。河行┦澄飼蚋邷仄茐臓I養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進行了消毒，保證了食品衛(wèi)生?！　。褐苯訉⒁镜奈锲贩湃肭逅?，煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。C。３）影響滅菌的因素　　。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。４）滅菌對培養(yǎng)基成分的影響　　。　　。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。新購的玻璃器皿　　除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于１～２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時間后再用清水洗凈。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種?！　。玻┰鲋撑囵B(yǎng)基 在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為了分離我們所需要的微生物，在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項 １、培養(yǎng)基配方的選定　　同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121176。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用?！　∧承┪窡岢煞郑缣穷?，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基?！　…傊泵媾囵B(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃60℃時，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。1176。培養(yǎng)基的保存　　培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。１、接種工具和方法　　在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。（圖３－３）　圖３－３　接種和分離工具1．接種針 　　　　　常用的接種方法有以下幾種：　　１）劃線接種 這是最常用的接種方法?！　。玻┤c接種 在研究霉菌形態(tài)時常用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的?！　。罚┳⑸浣臃N 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。２、無菌操作　　培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗臺上方，空氣流動應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。（圖３－５，a）圖３－５　傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 ２、涂布平板法　　首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖３－６）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。然后快速冷卻，并進行接種。三、培養(yǎng)　　微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。1) 營養(yǎng)物濃度 細菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān):μ=μmax*C/(K+C) 　　營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。在生長溫度三基點內(nèi)，微生物都能生長，但生長速率不一樣。也會死亡。３）水分　　水分是微生物進行生長的必要條件。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長?！　　　∵@類菌是需要氧氣的。分子氧存在對它們生長產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣?！　。荷顚右后w培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。　　液體培養(yǎng)：在實驗中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴散情況。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色?！　∥⑸餀z驗中常用的生化反應(yīng)有：１、糖酵解試驗　　不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。176。２、淀粉水解試驗　　某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。C培養(yǎng)24~48h，或于20176。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍色。３、VP試驗　　某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰