【正文】 微生物檢驗技術(shù)顯微技術(shù)　　顯微技術(shù)是微生物檢驗技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡?！　∫?、普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理：：　　光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺、鏡臂和底座等。（圖３－１）　　標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提高分辨率，標(biāo)準(zhǔn)目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進(jìn)入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小?！　★@微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。有些需要很強照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠础D３－１　光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖：　　顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時折射率為1，和載片玻璃的折射率（）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。 二、普通顯微鏡的使用方法低倍鏡觀察　　先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制射入光線的量，增加明暗差。高倍鏡觀察　　顯微鏡的設(shè)計一般是共焦點的。低倍鏡對準(zhǔn)焦點后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對準(zhǔn)焦點，只要稍微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點，或者是由于物鏡的更換而達(dá)不到共焦點，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像是否清晰。油浸鏡觀察　　油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點。沒有自動止降裝置的，對準(zhǔn)焦點的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點?！　∈褂糜徒R時，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。三、普通顯微鏡的保養(yǎng)　　顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺上標(biāo)本移動器的位置，罩上防塵套。　　鏡頭的保護最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團蘸取少量的二甲苯，輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可以在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉(zhuǎn)動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球?qū)⒍探q吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進(jìn)入鏡筒內(nèi)，落在鏡筒下面的物鏡上。四、顯微計數(shù)　　利用血球計數(shù)器在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常見的微生物計總數(shù)的方法。因為計數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。　　血球計數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)共分九個大方格，其中間的一個大方格用來做微生物計數(shù)，所以又稱為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種，一種是每個大方格分成16個中方格，每中方格又分成25個小方格。另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（2516或1625）400個小方格。（圖３－２）因為每個大方格邊長為1毫米，所以每個計數(shù)室（1個大方格）　　　圖３－２　兩種血球計數(shù)板a. 25X16計數(shù)板 。測出每個中方格菌數(shù)，就可以算出一個大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。　　一個大方格是16個中方格時，應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個中方格（即100個小方格）的菌數(shù)，一個大方格是25個中方格時，除取4角4個中方格外，還要數(shù)中央一個中方格（即為80個小方格）的菌數(shù)。計算公式如下：1625計數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每個小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)2516計數(shù)板：總菌數(shù)/ml=40010000稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)4106稀釋倍數(shù)染色技術(shù) 　　由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在8090%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運動性和直接計算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實情況，染色觀察時必須注意。　　本節(jié)包括四部分：一、染色的基本原理　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。　　細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。　　影響染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。 二、染料的種類和選擇　　染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類?！　∪玖峡砂雌潆婋x后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢?。酸性染料　　這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。堿性染料　　這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細(xì)菌易被堿性染料染色。中性（復(fù)合）染料　　酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。單純?nèi)玖稀　∵@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。三、制片和染色的基本程序　　微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。制片　　在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。自然干燥　　涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。固定　　標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個：　?。保⑺牢⑸?，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)?！　。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。　?。常└淖?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色?！　」潭ǔ３＠酶邷?，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色?！　∫陨线@種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法?；瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1—2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。染色　　標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標(biāo)本的時間平均約1—3分鐘，而所有的染色時間內(nèi)，整個涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中?！　∪糇鲝?fù)合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進(jìn)行。５、脫色　　用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色?？蓹z查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。６、復(fù)染　　脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。７、水洗　　染色到一定的時候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。８、干燥　　著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。９、鏡檢　　干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察?！　【C上所述，染色的基本程序如下：　　制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。四、染色方法　　微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。１、單染色法　　用一種染色劑對涂片進(jìn)行染色，簡便易行，適于進(jìn)行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細(xì)菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。　　單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟?！　∪旧Y(jié)果依染料不同而不同：　　石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色?！　　　∶捞m染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色?！　〔菟徜@結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。２、革蘭氏染色法　　革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立?！　〖?xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。　　革蘭氏陽性