【正文】 課題研究的意義和目的 ................................................................................................. 8 課題研究的內(nèi)容 ............................................................................................................. 8 2. 實(shí)驗(yàn)條件及預(yù)實(shí)驗(yàn) .................................................................................................................. 9 實(shí)驗(yàn)條件 ......................................................................................................................... 9 實(shí)驗(yàn)儀器 ............................................................................................................... 9 實(shí)驗(yàn)材料 ............................................................................................................... 9 實(shí)驗(yàn)藥品 ............................................................................................................. 11 預(yù)實(shí)驗(yàn) ........................................................................................................................... 11 BG11 培養(yǎng)液的配置 ............................................................................................ 11 高壓蒸氣滅菌 ..................................................................................................... 12 銅綠微囊藻的 接種 ............................................................................................. 12 銅綠微囊藻的 培養(yǎng) ............................................................................................. 12 實(shí)驗(yàn)方案論證 ............................................................................................................... 12 3. 實(shí)驗(yàn)方案與方法 .................................................................................................................... 14 四環(huán)素儲(chǔ)備液的配置 ................................................................................................... 14 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 ........................................................................... 14 實(shí)驗(yàn)原理 ............................................................................................................. 14 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 15 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 ................................................................................... 15 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 16 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ........................................................................... 16 實(shí)驗(yàn)原理 ............................................................................................................. 16 試劑配制 ............................................................................................................. 16 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 16 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠 微囊藻液中的降解 ............................................... 17 實(shí)驗(yàn)原理 ............................................................................................................. 17 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn) ............................................................................................................. 17 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 18 4. 結(jié)果與討論 ............................................................................................................................ 20 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 ........................................................................... 20 生長(zhǎng)曲線與抑制率 ....................................................................................................... 20 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 25 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ........................................................................... 26 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 ............................................... 28 標(biāo)準(zhǔn)曲線 ............................................................................................................. 28 降解曲線 ............................................................................................................. 31 5. 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 37 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 1 1. 引言（緒論） 抗生素的污染現(xiàn)狀 抗生素是一類生物（主要是真菌、放線菌或細(xì)菌等微生物）在其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有殺滅或抑制他種生物（主要是微生物）作用的化學(xué)物質(zhì)。 因此對(duì)該問(wèn)題更應(yīng)引起重視。目前在全球范圍內(nèi)幾乎所有地區(qū)都采用抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)增加產(chǎn)量、提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。 20 世紀(jì)40 年代末、 50 年代初，金霉素、土霉素和四環(huán)素相繼從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到，這 3種四環(huán)素類抗生素都顯示了完全的交叉抗性，有著相似的、廣泛的抗菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性菌、支原體、立克次體和衣原體之類的微生物都有活性。kg1實(shí)際上，四環(huán)素類抗生素的分布不可能如此均一，因此可以預(yù)測(cè)，部分地區(qū)的局部濃度要高于平均值。例如，通過(guò)對(duì)費(fèi)氏弧菌的長(zhǎng)達(dá) 24h毒性研究表明，四環(huán)素的 EC50值為 mgL1， 72 h 及 96h IC50值分別為 （ 95%置信區(qū)間為： ~ mg ［ 20］ 王志強(qiáng)運(yùn)用藻類抑制試驗(yàn)，以光密度法確定藻細(xì)胞的生物量，研究了獸醫(yī)臨床 12 種常用的抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性。研究表明，當(dāng)濃度高于 mmolL1，在每個(gè)濃度均觀察 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 5 到對(duì)水蚤生殖能力的影響，其影響較急性毒性水平低一個(gè)數(shù)量級(jí)。 四環(huán)素的 理化性質(zhì) 和藥理毒理 四環(huán)素 的理化性質(zhì) 該鹽酸鹽為 黃色 結(jié)晶性粉末；無(wú)臭，味苦；有引濕性；遇光色漸變深，在 堿性 溶液中易破壞失效。C。四環(huán)素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用優(yōu)于 革蘭陰性菌 ，但 腸球菌屬 對(duì)其耐藥。藍(lán)藻門分為兩綱：色球藻綱和藻殖段綱。 銅綠微囊藻較偏好高溫，但毒性與最高生長(zhǎng)率不一定有關(guān)聯(lián)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中， 32?C具有最高的生長(zhǎng)率，但毒性最強(qiáng)的溫度是 20?C。銅綠微囊藻的毒素是多膚類的肝毒素，主要引起動(dòng)物肝臟淤血腫大，并對(duì)肝細(xì)胞有破壞作用。 Shen等 ［ 28］ 報(bào)道太湖梅梁灣的微囊藻毒素隨時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)鹽水平的不同有很大差異，胞內(nèi)毒素最高可達(dá) μg/g干藻。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，包括上海、廈門、無(wú)錫及昆山在內(nèi)的部分城市自來(lái)水廠出水樣品中能檢測(cè)出 MC，部分樣品最大濃度接近甚至超過(guò)安全限值（ 1μg/L）。 課題研究的內(nèi)容 急性毒性是指 機(jī)體（人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物）一次（或 24 小時(shí)內(nèi)多次）接觸外來(lái)化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至引起死亡。3H2O、 MgSO45H2O、 Co(NO3)2H2O g/L 6 檸檬酸鐵銨 C12H22FeN3O14 g/L 7 乙二胺四乙酸二鈉 C10H14N2O8Na2隨后分別按上表所示在 FA1004 電子天平上稱取 硝酸鈉、磷酸氫二鉀 、硫酸鎂 、二水合氯化鈣 、檸檬酸 、檸檬酸鐵銨 、乙二胺四乙酸二鈉 、無(wú)水碳酸鈉 。 滅菌條件為在 121?C， MPa 下滅菌 30 分鐘，待滅菌鍋壓力指示為 0 MPa 時(shí)，將滅菌后的培養(yǎng)液取出 置于避光處 存放 。 銅綠微囊藻的 培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為 SPXGB150 人工智能氣候箱。四環(huán)素類藥物對(duì)微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成最終造成對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制。這些條件為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。 已知： 1 cm3體積 =10 mm10 mm10 mm= 1000 mm3 所以： mm3體積應(yīng)含有 中 方格數(shù)為 25，即系數(shù) K=105 。分別測(cè)定 2 47 9 1 144 小時(shí)各藻樣的吸光度，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的生長(zhǎng)曲線，并求 EC(5