【正文】 色的差異進(jìn)行比色測(cè)定，適合于蛋白質(zhì)類(lèi)的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液： mg/mL 牛血清蛋白。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 17 表 31 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 mg/mL 牛血清蛋白 蒸餾水 考馬斯亮藍(lán) 將 10 個(gè) 100 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液。測(cè)定吸光度時(shí)，先從 100 mL 三角燒瓶中取出 30 mL，移至燒杯，在細(xì)胞破碎儀下破碎 10 分鐘（破碎 3 秒，停 3 秒），隨后取經(jīng)破碎的藻液于離心機(jī)下離心（ 3000r/m），取離心后上清液 1 mL 于 10 mL 試管中加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)，震蕩均勻，并靜置 20 分鐘，隨后在 595 nm 下測(cè)定吸光度。 實(shí)驗(yàn) 特點(diǎn) 高效液相色譜法有 “ 四高一廣 ” 的特點(diǎn)： （ 1） 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì) 載液 加高壓。 （ 4） 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá) ng， 進(jìn)樣量在 μL數(shù)量級(jí)。編號(hào)為 1～ 3 的 3 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按濃度從小到大依次進(jìn)樣，分別求出儀器的檢測(cè)限和四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在 Excel 中線性擬合 后得到數(shù)據(jù)具有顯著地線性相關(guān)性。 y = + R178。 圖 41 吸光度和銅綠微囊藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系 易得 680 nm 波長(zhǎng)下，銅綠微囊藻細(xì)胞的吸光度和藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系為： 2212 .78 4 , 9Y x R? ? ? （ 41） 生長(zhǎng)曲線與抑制率 基于以上實(shí)驗(yàn)，我在進(jìn)行四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)上，將藻細(xì)胞接種初始時(shí)刻的吸光度值控制為 Abs，即相當(dāng)于 106個(gè) /mL。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 20 4. 結(jié)果與討論 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得藻液吸光度，并使用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡計(jì)量相對(duì)應(yīng)吸光度下銅綠微囊藻細(xì)胞的個(gè)數(shù)，匯總兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 并 篩選 。 測(cè)定銅綠微囊藻藻液中四環(huán)素含量前，首先配置、測(cè)定并繪制四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 本實(shí)驗(yàn)采用反向分配色譜法，使用 C18 色譜柱，采用 15%:85%（乙腈（色譜純）：檸檬酸溶液 pH 約 ） 作為流動(dòng)相。 （ 3） 高效：分離效能高。這種互作用力通常是 分析物 及 分析管柱 之間的一種非共價(jià)性質(zhì)。標(biāo)號(hào)為 3 和 4 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 5～ 7 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 8～ 10 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。用分光光度計(jì)比色測(cè)定吸光值 A595nm。 試劑配制 染色液：取考馬斯亮藍(lán) G250 100 mg 溶于 50 mL 85%磷酸，加水稀釋至一升。由于蛋白質(zhì) —— 考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在 595 nm 處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在 465 nm 處的光吸收，因此，可大大地提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。編號(hào)為 0～ 3 的 4 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 將 16 個(gè) 50 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL。 銅綠微囊藻生物量的測(cè)定： 通過(guò)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻類(lèi)計(jì)數(shù)和在波長(zhǎng) 680nm下測(cè)定藻類(lèi)光密度，建立不同藻類(lèi)細(xì)胞密度和光密度之間線性關(guān)系，以計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞濃度和光密度表示藻生物量，通過(guò)二者線性關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為 mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為 mm3，每個(gè)小方格的體積為 1/4000 mm3。 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)原理 我們采用微生物的 光學(xué)顯微鏡 直接計(jì)數(shù)法。 在 硬件上，學(xué)校測(cè)試中心擁有本項(xiàng)目所需的大型設(shè)備： 紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)、細(xì)胞破碎儀、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、電子顯微鏡、滅菌鍋 等。四環(huán) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 13 素類(lèi)抗生素能夠抑制水生動(dòng)物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈 O去乙基酶、β 半乳糖苷酶等，并可能造成魚(yú)類(lèi)較嚴(yán)重的 DNA 損傷。 白天黑夜 時(shí)間 比為 12h:12h。三角燒瓶應(yīng)用 四層紗布封口以防污染 和傾倒 ， 培養(yǎng)前藻液應(yīng)當(dāng)為淺綠色，經(jīng)過(guò) 7 天的培養(yǎng)，藻液顏色變化為翠綠色。上午接種可以吸取上浮的運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)的藻細(xì)胞做藻種，棄去底部沉淀的藻細(xì)胞，起到擇優(yōu)的作用。等到需要用時(shí)方才取出 。 高壓蒸氣滅菌法是利用適當(dāng)溫度和壓力的飽和水蒸氣加熱殺滅微生物的一種方法。 配置后均需超聲溶解并混合均勻。6H2O g/L 上表為 BG11 培養(yǎng)基配置的具體方法。4H2O g/L 93 硫酸鋅 ZnSO47H2O g/L 4 二水合氯化鈣 CaCl2 以上實(shí)驗(yàn)藥品均為上海展云化工有限公司的分析純藥品。7H2O、 Na2MoO42H2O、 C6H8O7 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 9 2. 實(shí)驗(yàn)條件及預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)儀器 BXM30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠） JY962N 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司） RJTGL16B 高速離心機(jī)（無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司） FA1004 電子天平（上海?？惦娮觾x器廠） PHS3CpH 計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司） 超聲儀（上海寧商超聲儀器有限公司） TU1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司） SPXGB150 光照培養(yǎng)箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司） BCD108S（康佳冷藏冷凍箱） 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司） Dragonlab TopPette 移液槍 1000 μL、 200 μL LabTech 高效液相色譜儀 UV600 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器（北京萊伯泰科儀器有限公司） 針頭過(guò)濾器（郭店桃園醫(yī)療化工儀器廠，海寧市） 實(shí)驗(yàn)材料 10 mL、 25 mL 容量瓶各 1 個(gè) 50 mL、 100 mL 三角燒瓶 各 15 個(gè) 250 mL、 500 mL 三角燒瓶各 2 個(gè) 10 mL 試管 20 支 100 mL 燒杯 4 個(gè) 、 250 mL、 500 ml 燒杯各一個(gè) 50 mL、 100 mL、 250 mL 量筒各 1 個(gè) 4 L 培養(yǎng)液儲(chǔ)備瓶 1 個(gè) 石英比色皿 2 對(duì) 100 μL微量進(jìn)樣針 1 支 200 μL、 1000 μL移液槍頭若干 mL、 mL 離心管若干 一次性無(wú)菌注射器若干 稱量紙、擦鏡紙若干 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 10 圖 21 實(shí)驗(yàn)室部分儀器設(shè)備 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 11 實(shí)驗(yàn)藥品 純水、 無(wú)水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。藻類(lèi)生長(zhǎng)因子包括光照、二氧化碳、適宜的溫度、 pH值及氮、磷、微量元素等其他營(yíng)養(yǎng)成分，這些因子的變化會(huì)刺激或抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)。 這 對(duì) 四環(huán)素 類(lèi)抗生素 的應(yīng)用，評(píng)價(jià)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，減少毒害是 十分 重要的 。二次供水的污染情況要大于管網(wǎng)水，重慶涪陵區(qū)城鄉(xiāng)用水的二次供水中檢測(cè)出 MC 最大濃度為 μg/L（ 20xx 年 9 月）， 10 月份農(nóng)村井水中 MC 平均含量為 μg/L。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 8 飲用水的微囊藻毒素污染 除天然水體及水庫(kù)源水中普遍檢測(cè)出 MC 外，飲用水也存在 MC 污染。王紅兵等曾檢測(cè)到上海淀山湖水體中 MC 濃度最高可達(dá) ng/mL。此外，長(zhǎng)江、黃河、松花江中下游等主要河流以及鄱陽(yáng)湖、武漢東湖、上海淀山湖等幾大淡水湖泊、水庫(kù)中也都相繼發(fā)生了不同程度的藍(lán)藻水華污染并檢測(cè)到了 MC 的存在，目前對(duì)我國(guó)南北幾個(gè)省市各水體都有不同程度的 MC 污染，其中以溝塘水、河水和水庫(kù)水最為嚴(yán)重。自然界中水華暴發(fā)時(shí)，若無(wú)外來(lái)影響使其迅速溶解，水體中的毒素含量至多只有 ～ 10 μg/L，而細(xì)胞內(nèi)的毒素則會(huì)高出幾個(gè)數(shù)量級(jí) ［ 26］ 。野生動(dòng)物、家畜及家禽飲用了含有毒藻及藻毒的水后，會(huì)引起中毒甚至死亡，人飲用后也會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，因此當(dāng)作為飲用水源的湖泊、水庫(kù)和河流中出現(xiàn)藍(lán)藻水華時(shí)，則應(yīng) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 7 引起注意。銅綠微囊藻對(duì)光照度要求不高，較低光照度即可快速增長(zhǎng)，光照度 20xx～ 6000 Lx 適宜銅綠微囊藻快速增殖，在 4000 Lx 時(shí)生長(zhǎng)最快。 原生質(zhì)體 的顏色是淺藍(lán)綠色，但因細(xì)胞中具有充滿空氣的 囊泡 在光下可能呈暗色，這是 光學(xué)顯微鏡 下微囊藻的鑒別特征之一。藍(lán)藻在地球上分布十分廣泛，遍及世界各地，但大多數(shù)（約 75%）淡水產(chǎn)，少數(shù)海產(chǎn)；有些藍(lán)藻可生活在 60～ 85?C 的溫泉中；有些種類(lèi)和菌、苔蘚、蕨類(lèi)和裸子植物共生；有些還可穿入鈣質(zhì)巖石或介殼中（如穿鈣藻類(lèi)）或土壤深層中（如土壤藍(lán)藻）。 藍(lán)藻 、銅綠微囊藻 藍(lán)藻概述 藍(lán)藻和具原核的細(xì)菌等一起，單立為原核生物界。四環(huán)素對(duì)淋病奈瑟菌具一定抗菌活性，但 耐青霉素 的淋球菌對(duì)四環(huán)素也耐藥。 四環(huán)素 的藥理毒理 四環(huán)素為廣譜抑菌劑，高濃度時(shí)具殺菌作用。用于治療肺炎、斑疹傷寒、 阿米巴 痢等。 密度： g/cm3； 沸點(diǎn)： 176。 分子式 C20H24N2O8，分子量 。L1和 828 mgL1（ 95%置信區(qū)間為： ~ mg結(jié)果表明，土霉素的 48h EC50超過(guò) 1000 mg根的生長(zhǎng)較發(fā)芽對(duì)土霉素更為敏感，土霉素對(duì)紫花苜蓿發(fā)芽及根生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)61%和 85%。當(dāng)土霉 素濃度升高時(shí)，紫花苜蓿的葉子出現(xiàn)變黃現(xiàn)象，四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)紫花苜蓿的毒性可能是由于四環(huán)素與葉綠體合酶結(jié)構(gòu)相似，因此四環(huán)素抑制了葉綠體翻譯活性及葉綠體合酶的活性。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 4 表 11 抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性 抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性 藥物 濃度范圍 48hEC50 72hEC50 96hEC50 紅霉素 泰樂(lè)菌素 替米考星 泰妙菌素 新霉素 阿米卡星 卡那霉素 —— —— —— 氟苯尼考 恩諾沙星 3 諾氟沙星 —— —— —— 四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)植物的生態(tài)毒性 目前四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)植物的生態(tài)毒性的研究主要集中在對(duì)實(shí)驗(yàn)室模擬條件下水生植物和陸生植物的水培養(yǎng)條件下的毒性研究。L1［ 19］ ，土霉素能抑制等鞭金藻葉綠素含量的生成，并且藥量越大抑制作用越強(qiáng)；對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的生成起促進(jìn)作用，藥量越大則類(lèi)胡蘿卜素含量越多。L1（ 95%置信區(qū)間：~ mgL1溶液中扁藻的生長(zhǎng)抑制顯著， NOEC 值為 mg Ferreira 等同時(shí)研究了四環(huán)素對(duì)扁藻的和鹵蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制情況，結(jié)果表明，扁藻對(duì)四環(huán)素的敏感度大約為鹵蟲(chóng)的 70 倍，這一規(guī)律也被許多類(lèi)似實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證 ［ 15～ 18］ 。 四環(huán)素類(lèi)抗生素的生態(tài)毒性 四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)微生物的生態(tài)毒性 由于四環(huán)素類(lèi)抗生素主要用來(lái)抑制菌類(lèi)物質(zhì)的生長(zhǎng)發(fā)育，因此近年來(lái)研究者們對(duì)于四環(huán)素對(duì)細(xì)菌、真菌和微藻等的生態(tài)毒性做了廣泛研究。 由此可見(jiàn)，四環(huán)素類(lèi)抗生素的污染作為一個(gè)全球性普遍存在的問(wèn)題，這類(lèi)物質(zhì)一般均具備高生物活性和持久性，這就決定了其必然具有一定的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。k1的四環(huán)素 ［ 8］ 。結(jié)果表明，土霉素在糞肥中的半衰期為 30 d，在糞肥熟化 5 個(gè)月后仍然檢測(cè)到土霉素的殘留，含量達(dá)到 820 μg有報(bào)道顯示：土霉素在綿羊糞便中殘留 21%，金霉素在小公牛糞便中殘留 17%~75%［ 6］ 。目前，四環(huán)素類(lèi)抗生素中最主要種類(lèi)包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，其他半 合成制取種類(lèi)主要包括甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺基四環(huán)素等。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用，是抗生素進(jìn)入水環(huán)境的一個(gè)重要途徑 ［ 3］ 。例如，綿羊口服的土霉素中 21%通過(guò)尿液排出體外，而 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 2 對(duì)于幼牛 17~75%的氯四環(huán)素未經(jīng)代謝就以母體化合物的形態(tài)被排出體外。因此，對(duì)于含有抗 生素的醫(yī)院污水或城市生活污水，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)處理，只要實(shí)施排放，均可以導(dǎo)致對(duì)地表水、地下水以及農(nóng)田土壤環(huán)境的污染。濫用抗生素使得抗生素以活性形式存在于污水中。 含有抗生素的畜禽糞便的土地利用是土壤中抗生素類(lèi)污染物的主要來(lái)源?？股啬茉诓煌潭?