【正文】 y = + R178。 圖 41 吸光度和銅綠微囊藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系 易得 680 nm 波長(zhǎng)下，銅綠微囊藻細(xì)胞的吸光度和藻細(xì)胞個(gè)數(shù)的線性關(guān)系為： 2212 .78 4 , 9Y x R? ? ? （ 41） 生長(zhǎng)曲線與抑制率 基于以上實(shí)驗(yàn)，我在進(jìn)行四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)上，將藻細(xì)胞接種初始時(shí)刻的吸光度值控制為 Abs，即相當(dāng)于 106個(gè) /mL。 在 Excel 中線性擬合 后得到數(shù)據(jù)具有顯著地線性相關(guān)性。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 20 4. 結(jié)果與討論 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得藻液吸光度，并使用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡計(jì)量相對(duì)應(yīng)吸光度下銅綠微囊藻細(xì)胞的個(gè)數(shù)，匯總兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 并 篩選 。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按濃度從小到大依次進(jìn)樣，分別求出儀器的檢測(cè)限和四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定銅綠微囊藻藻液中四環(huán)素含量前，首先配置、測(cè)定并繪制四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。編號(hào)為 1～ 3 的 3 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 本實(shí)驗(yàn)采用反向分配色譜法，使用 C18 色譜柱，采用 15%:85%（乙腈（色譜純）：檸檬酸溶液 pH 約 ） 作為流動(dòng)相。 （ 4） 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá) ng， 進(jìn)樣量在 μL數(shù)量級(jí)。 （ 3） 高效：分離效能高。 實(shí)驗(yàn) 特點(diǎn) 高效液相色譜法有 “ 四高一廣 ” 的特點(diǎn)： （ 1） 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì) 載液 加高壓。這種互作用力通常是 分析物 及 分析管柱 之間的一種非共價(jià)性質(zhì)。測(cè)定吸光度時(shí)，先從 100 mL 三角燒瓶中取出 30 mL，移至燒杯，在細(xì)胞破碎儀下破碎 10 分鐘（破碎 3 秒，停 3 秒），隨后取經(jīng)破碎的藻液于離心機(jī)下離心（ 3000r/m），取離心后上清液 1 mL 于 10 mL 試管中加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)，震蕩均勻，并靜置 20 分鐘，隨后在 595 nm 下測(cè)定吸光度。標(biāo)號(hào)為 3 和 4 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 5～ 7 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 8～ 10 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 17 表 31 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 mg/mL 牛血清蛋白 蒸餾水 考馬斯亮藍(lán) 將 10 個(gè) 100 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液。用分光光度計(jì)比色測(cè)定吸光值 A595nm。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液： mg/mL 牛血清蛋白。 試劑配制 染色液：取考馬斯亮藍(lán) G250 100 mg 溶于 50 mL 85%磷酸，加水稀釋至一升。利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測(cè)定，適合于蛋白質(zhì)類(lèi)的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。由于蛋白質(zhì) —— 考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在 595 nm 處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在 465 nm 處的光吸收，因此，可大大地提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán) G250 是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍(lán)色染料，在 465 nm 處有最大吸收值。編號(hào)為 0～ 3 的 4 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 4～ 6 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 7～ 9 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 10～ 12 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 13～ 15 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。分別測(cè)定 2 47 9 1 144 小時(shí)各藻樣的吸光度，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的生長(zhǎng)曲線，并求 EC(50,96h)。 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 將 16 個(gè) 50 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL。進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，第一次試驗(yàn)，將原液分別稀釋 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍和 50 倍，測(cè)定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機(jī)選取 25 個(gè)中格中的 5 個(gè)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并換算計(jì)算藻密度，第二次實(shí)驗(yàn)，分別將原藻樣稀釋 20 倍、 30 倍、 40 倍、 50 倍、 60 倍和 100 倍，測(cè)定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機(jī)選取 25 個(gè)中格中的 9 個(gè)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并換算計(jì)算藻密度。 銅綠微囊藻生物量的測(cè)定： 通過(guò)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻類(lèi)計(jì)數(shù)和在波長(zhǎng) 680nm下測(cè)定藻類(lèi)光密度，建立不同藻類(lèi)細(xì)胞密度和光密度之間線性關(guān)系，以計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞濃度和光密度表示藻生物量，通過(guò)二者線性關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。 已知： 1 cm3體積 =10 mm10 mm10 mm= 1000 mm3 所以： mm3體積應(yīng)含有 中 方格數(shù)為 25，即系數(shù) K=105 。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為 mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為 mm3，每個(gè)小方格的體積為 1/4000 mm3。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成 25 個(gè)大方格（大方格之間用雙線分開(kāi)），而每個(gè)大方格又分成 16 個(gè)小方格 共計(jì) 由 400 個(gè)小方格組成。 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)原理 我們采用微生物的 光學(xué)顯微鏡 直接計(jì)數(shù)法。這些條件為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。 在 硬件上，學(xué)校測(cè)試中心擁有本項(xiàng)目所需的大型設(shè)備： 紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)、細(xì)胞破碎儀、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、電子顯微鏡、滅菌鍋 等。 就 技術(shù) 而言， 實(shí)驗(yàn)室對(duì) 本項(xiàng)目開(kāi)展了前期研究，結(jié)果表明本項(xiàng)目在科學(xué)上和技術(shù)上是可行的。四環(huán) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 13 素類(lèi)抗生素能夠抑制水生動(dòng)物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈 O去乙基酶、β 半乳糖苷酶等，并可能造成魚(yú)類(lèi)較嚴(yán)重的 DNA 損傷。四環(huán)素類(lèi)藥物對(duì)微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成最終造成對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制。 白天黑夜 時(shí)間 比為 12h:12h。?C，光照在 20xx～ 4000 Lx 連續(xù)靜止培養(yǎng)。三角燒瓶應(yīng)用 四層紗布封口以防污染 和傾倒 ， 培養(yǎng)前藻液應(yīng)當(dāng)為淺綠色，經(jīng)過(guò) 7 天的培養(yǎng)，藻液顏色變化為翠綠色。 銅綠微囊藻的 培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為 SPXGB150 人工智能氣候箱。上午接種可以吸取上浮的運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)的藻細(xì)胞做藻種，棄去底部沉淀的藻細(xì)胞，起到擇優(yōu)的作用。 銅綠微囊藻的 接種 銅綠微囊藻 FACHB 905 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生所（武漢，中國(guó)）。等到需要用時(shí)方才取出 。 滅菌條件為在 121?C， MPa 下滅菌 30 分鐘，待滅菌鍋壓力指示為 0 MPa 時(shí)，將滅菌后的培養(yǎng)液取出 置于避光處 存放 。 高壓蒸氣滅菌法是利用適當(dāng)溫度和壓力的飽和水蒸氣加熱殺滅微生物的一種方法。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 12 高壓蒸氣 滅菌 滅菌是指用物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物以及 芽孢 ，使之達(dá)到無(wú)菌保障水平。 配置后均需超聲溶解并混合均勻。隨后分別按上表所示在 FA1004 電子天平上稱(chēng)取 硝酸鈉、磷酸氫二鉀 、硫酸鎂 、二水合氯化鈣 、檸檬酸 、檸檬酸鐵銨 、乙二胺四乙酸二鈉 、無(wú)水碳酸鈉 。6H2O g/L 上表為 BG11 培養(yǎng)基配置的具體方法。2H2O g/L 95 硫酸銅 CuSO44H2O g/L 93 硫酸鋅 ZnSO4H2O g/L 6 檸檬酸鐵銨 C12H22FeN3O14 g/L 7 乙二胺四乙酸二鈉 C10H14N2O8Na27H2O g/L 4 二水合氯化鈣 CaCl2 表 21 配置 BG11培養(yǎng)液 編號(hào) 成分 化學(xué)式 單位含量 含量 1 硝酸鈉 NaNO3 g/L 2 磷酸氫二鉀 K2HPO4 以上實(shí)驗(yàn)藥品均為上海展云化工有限公司的分析純藥品。5H2O、 Co(NO3)27H2O、 Na2MoO42H2O、 Na2CO H3BO MnCl22H2O、 C6H8O73H2O、 MgSO4 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 9 2. 實(shí)驗(yàn)條件及預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)儀器 BXM30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠） JY962N 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司） RJTGL16B 高速離心機(jī)（無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司） FA1004 電子天平（上海?？惦娮觾x器廠） PHS3CpH 計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司） 超聲儀（上海寧商超聲儀器有限公司） TU1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司） SPXGB150 光照培養(yǎng)箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司） BCD108S（康佳冷藏冷凍箱） 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司） Dragonlab TopPette 移液槍 1000 μL、 200 μL LabTech 高效液相色譜儀 UV600 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器（北京萊伯泰科儀器有限公司） 針頭過(guò)濾器（郭店桃園醫(yī)療化工儀器廠，海寧市） 實(shí)驗(yàn)材料 10 mL、 25 mL 容量瓶各 1 個(gè) 50 mL、 100 mL 三角燒瓶 各 15 個(gè) 250 mL、 500 mL 三角燒瓶各 2 個(gè) 10 mL 試管 20 支 100 mL 燒杯 4 個(gè) 、 250 mL、 500 ml 燒杯各一個(gè) 50 mL、 100 mL、 250 mL 量筒各 1 個(gè) 4 L 培養(yǎng)液儲(chǔ)備瓶 1 個(gè) 石英比色皿 2 對(duì) 100 μL微量進(jìn)樣針 1 支 200 μL、 1000 μL移液槍頭若干 mL、 mL 離心管若干 一次性無(wú)菌注射器若干 稱(chēng)量紙、擦鏡紙若干 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 10 圖 21 實(shí)驗(yàn)室部分儀器設(shè)備 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 11 實(shí)驗(yàn)藥品 純水、 無(wú)水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。所以，通過(guò)測(cè)定藻類(lèi)的數(shù)量就可以評(píng)價(jià)有毒有害污染物對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響及對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的綜合環(huán)境效應(yīng)。藻類(lèi)生長(zhǎng)因子包括光照、二氧化碳、適宜的溫度、 pH值及氮、磷、微量元素等其他營(yíng)養(yǎng)成分，這些因子的變化會(huì)刺激或抑制藻類(lèi)的生長(zhǎng)。 課題研究的內(nèi)容 急性毒性是指 機(jī)體（人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物）一次（或 24 小時(shí)內(nèi)多次）接觸外來(lái)化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至引起死亡。 這 對(duì) 四環(huán)素 類(lèi)抗生素 的應(yīng)用，評(píng)價(jià)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，減少毒害是 十分 重要的 。 而 關(guān)于四環(huán)素的急性毒性效應(yīng)的研究還非常有限，四環(huán)素 對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者 —— 藻類(lèi) 的 毒性的研究 尚不夠多 。二次供水的污染情況要大于管網(wǎng)水，重慶涪陵區(qū)城鄉(xiāng)用水的二次供水中檢測(cè)出 MC 最大濃度為 μg/L（ 20xx 年 9 月）， 10 月份農(nóng)村井水中 MC 平均含量為 μg/L。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，包括上海、廈門(mén)、無(wú)錫及昆山在內(nèi)的部分城市自來(lái)水廠出水樣品中能檢測(cè)出 MC，部分樣品最大濃度接近甚至超過(guò)安全限值（ 1μg/L）。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 8 飲用水的微囊藻毒素污染 除天然水體及水庫(kù)源水中普遍檢測(cè)出 MC 外，飲用水也存在 MC 污染。廣東省典型供水水庫(kù)和淡水湖泊微囊藻毒素分布廣泛，毒素組成以 MCRR 為主，水庫(kù)微囊藻毒素含量在 0～ μg/L。王紅兵等曾檢測(cè)到上海淀山湖水體中 MC 濃度最高可達(dá) ng/mL。 Shen等 ［ 28］ 報(bào)道太湖梅梁灣的微囊藻毒素隨時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)鹽水平的不同有很大差異，胞內(nèi)毒素最高可達(dá) μg/g干藻。此外，長(zhǎng)江、黃河、松花江中下游等主要河流以及鄱陽(yáng)湖、武漢東湖、上海淀山湖等幾大淡水湖泊、水庫(kù)中也都相繼發(fā)生了不同程度的藍(lán)藻水華污染并檢測(cè)到了 MC 的存在，目前對(duì)我國(guó)南北幾個(gè)省市各水體都有不同程度的 MC 污染，其中以溝塘水、河水和水庫(kù)水最為嚴(yán)重。 天然及水庫(kù)水體的微囊藻毒素污染 我國(guó)是一個(gè)湖泊眾多的國(guó)家， 20 世紀(jì) 90 年代以來(lái)，藍(lán)藻水華暴發(fā)的面積、強(qiáng)度以及藻毒素含量均在大幅度增長(zhǎng)，由此帶來(lái)的環(huán)境和生物安全問(wèn)題日益引起關(guān)注。自然界中水華暴發(fā)時(shí)，若無(wú)外來(lái)影響使其迅速溶解，水體中的毒素含量至多只有 ～ 10 μg/L，而細(xì)胞內(nèi)的毒素則會(huì)高出幾個(gè)數(shù)量級(jí) ［ 26］ 。銅綠微囊藻的毒素是多膚類(lèi)的肝毒素，主要引起動(dòng)物肝臟淤血腫大，并對(duì)肝細(xì)胞有破壞作用。野生動(dòng)物、家畜及家禽飲用了含有毒藻及藻毒的水后，會(huì)引起中毒甚至死亡，人飲用后也會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，因此當(dāng)作為飲用水源的湖泊、水庫(kù)和河流中出現(xiàn)藍(lán)藻水華時(shí)，則應(yīng) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 7 引起注意。 藻類(lèi)水華 在許多富營(yíng)養(yǎng)化水體中，由于藍(lán)藻的增殖，