【正文】 實(shí)驗(yàn)于每天下午 13:0014:00 測(cè)定各瓶 銅綠微囊藻 藻樣的吸光度值 。 最終取以下數(shù)據(jù)：將原藻液稀釋 100 倍得吸光度為 ，藻密度為 105個(gè) /mL；稀釋 50 倍得吸光度為 ，藻密度為 105個(gè) /mL；將原藻液稀釋 20 倍得吸光度為，藻密度為 105個(gè) /mL；稀釋 10倍得吸光度為 ，藻密度為 105個(gè) /mL；將原藻液稀釋 5倍得吸光度為 ，藻密度為 105個(gè) /mL；而培養(yǎng)基的吸光度 ，藻密度為 105個(gè) /mL。取 10 mL 潔凈試管 17 支，并逐一配置以下濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液： 100 mg/L、 50 mg/L、 25 mg/L、 10 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 50 μg/L、 25 μg/L、 10 μg/L、 μg/L、 μg/L。 圖 32 高效液相色譜法測(cè)定四環(huán)素在銅綠微囊藻中的降解實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法 將 15 個(gè) 100 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。使用高效液相色譜時(shí)， 液體 待檢測(cè)物在不同的時(shí)間被注入色譜柱，通過(guò) 壓力 在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相 的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，每個(gè)峰頂都代表一個(gè)另外 化合物 的種類，最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。分別測(cè)定 7 144 小時(shí)吸光度。以 A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該染色液可保存數(shù)月，若不加水可長(zhǎng)期保存，用前稀釋。蛋白質(zhì) —— 考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。測(cè)定第 0、 4 9144 小時(shí)各藻樣的 pH，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的 pH 變化規(guī)律曲線。編號(hào)為 0～ 3 的 4 瓶藻樣作為控制樣參照，不添加抗生素；標(biāo)號(hào)為 28～ 30 的，控制四環(huán)素濃度為 1 mg/L；標(biāo)號(hào)為 31～ 33 的，控制四環(huán)素濃度為 2 mg/L；標(biāo)號(hào)為 34～ 36 的，控制四環(huán)素濃度為 5 mg/L；標(biāo)號(hào)為 37～ 39 的，控制四環(huán)素濃度為 10 mg/L。 銅綠微囊藻相對(duì)增長(zhǎng)速率 K的計(jì)算： 0( ln ln ) /tK N N t?? （ 31） 式中 K—— 相對(duì)增長(zhǎng)率 Nt—— 處理 t時(shí)刻的細(xì)胞密度 (個(gè) / mL) N0 —— 起始密度 (個(gè) / mL)， t—— 培養(yǎng)時(shí)間 ρ—— 生長(zhǎng)阻礙率 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 15 實(shí)驗(yàn)方法 使用血球計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)一定濃度下，藻細(xì)胞個(gè)數(shù)。 使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè) 中 方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有 4 條槽而構(gòu)成 3 個(gè)平臺(tái)。具備完成本課題所需的 吸光度的測(cè)定以及生長(zhǎng)曲線的繪制、毒理學(xué) 實(shí)驗(yàn)的先進(jìn)儀器設(shè)備和良好工作條件。我們的課題四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究在理論上是能夠得到支持的。 實(shí)驗(yàn)方案論證 諸多文獻(xiàn)闡明，四環(huán)素類抗生素能微生物、植物和動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生影響。 藻液的培養(yǎng)環(huán)境為： 溫度為 25177。 接種時(shí)一般選 250 mL 三角燒瓶接種原藻液 50 mL 并加入新配培養(yǎng)液 100～ 150 mL 或選取 500 mL 的三角燒瓶接種原藻液 100 mL 并加入新配培養(yǎng)液 250 mL。本實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)器皿均須滅菌操作。 實(shí)驗(yàn)采用 BXM30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋，對(duì)實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)液（培養(yǎng)基）、以及潔凈的容量瓶、三角燒瓶、燒杯、試管等進(jìn)行滅菌。 再取 1000 μL的Dragonlab TopPette 移液槍 移取 A5 液 4 mL 加入上述 4 L 的玻璃瓶中。首先取一 潔凈 的 4 L 玻璃瓶，加入 4 L 純凈水（實(shí)驗(yàn)采用 娃 哈哈瓶裝純凈水） 。7H2O g/L 94 鉬酸鈉 Na2MoO42H2O g/L 5 檸檬酸 C6H8O7 預(yù)實(shí)驗(yàn) BG11 培養(yǎng)液的配置 本實(shí)驗(yàn)所配培養(yǎng)液為 BG11 培養(yǎng)液，每次配制 1 瓶（ 4 L）。2H2O、CuSO4H2O、 C12H22FeN3O1C10H14N2O8Na2 NaNO K2HPO4在一定環(huán)境條件下，如果某種有毒有害的化學(xué)物質(zhì)及其復(fù)合污染物進(jìn)入水體，藻類的生命活動(dòng)就會(huì)受到影響，生物量就會(huì)發(fā)生改變。 因此， 選用 淡水藻銅綠微囊藻為研究對(duì)象，研究四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性是具有現(xiàn)實(shí)意義的 。 課題研究 的 意義 和目的 無(wú)論是抗生素還是銅綠微囊藻水華 引起的水體污染 都是當(dāng)今水生態(tài)環(huán)境面臨的重要問(wèn)題，而兩者 普遍存在于水體中，共存的可能性很大。澳大利亞某清澈湖水處理的自來(lái)水樣品檢測(cè)出 MC(1～ 23 pg/mL)，加拿大 Alberta 地區(qū)某湖來(lái)源的自來(lái)水樣品 MCLR 含量在 100～ 1000 pg/mL 之間。 20xx 年對(duì)北京市重要飲用水水源地官?gòu)d水庫(kù)、密云水庫(kù)和懷柔水庫(kù)水源水樣進(jìn)行藻毒素調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在藻類的高發(fā)季節(jié)， 3 個(gè)水庫(kù)水體中均檢出 MC，其中官?gòu)d水庫(kù) 7月份 MC 最高值達(dá)到 20 μg/L。 Song 等 ［ 27］ 于 20xx年在太湖五里湖和梅梁灣檢測(cè)的表層水最大胞外 MC 含量分別為 和 μg/L。大型湖泊、河流中藍(lán)藻釋放的藻毒素可被大量水體稀釋，但大規(guī)模藍(lán)藻水華溶解時(shí)，就會(huì)使毒素達(dá)到較高濃度，造成潛在危害。水華能夠引起家畜和禽類中毒死亡以來(lái)，已證實(shí)有十一多種藍(lán)藻能夠引起動(dòng)物中毒甚至死亡，其中銅綠微囊藻、水華魚(yú)腥藻和水華束絲藻是形成淡水藍(lán)藻水華的主要種類，故有關(guān)的研究較多。除了毒素外，銅綠微囊藻形成水華時(shí)淡水溶氧量的顯著降低也會(huì)導(dǎo)致水中動(dòng)物的死亡。囊泡提供微囊藻足夠的浮力，使其停留在有足夠光線和 二氧化碳 提供生長(zhǎng)的水層。 銅綠微囊藻概述 銅綠微囊藻是常見(jiàn)的水華藍(lán)藻，屬原核生物界、真細(xì)菌、藍(lán)藻門(mén)、藍(lán)藻綱、色球藻目、微囊藻科、微囊藻屬。所有的藍(lán)藻都含有一種特殊的藍(lán)色色素，藍(lán)藻就是因此得名。四環(huán)素對(duì)弧菌、鼠疫桿菌、 布魯菌屬 、彎曲桿菌、耶爾森菌等革蘭陰性菌抗菌作用良好，對(duì)銅綠假單 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 6 胞菌無(wú)抗菌活性，對(duì)部分 厭氧菌屬 細(xì)菌具一定抗菌作用，但遠(yuǎn)不如甲硝唑、克林霉素和氯霉素，因此臨床上并不選用。除了常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌以及厭氧菌外，多數(shù)立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體也對(duì)本品敏感。供口服。C at 760 mmHg； 蒸汽壓： 0 mmHg at 25176。黃色晶體，熔點(diǎn) 170～ 175176。L1。L1）和 mgL1，而四環(huán)素的 NOEC 值為 340 mg 四環(huán)素類抗生素對(duì)動(dòng)物的 生態(tài)毒性 四環(huán)素類抗生素能夠抑制水生動(dòng)物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈 O去乙基酶、β 半乳糖苷酶等，并可能造成魚(yú)類較嚴(yán)重的 DNA 損傷。 ［ 2 24］ Kong 等 ［ 25］ 通過(guò)一系列溶液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)于紫花苜蓿對(duì)土霉素的攝取情況及土霉素對(duì)紫花苜蓿發(fā)芽及根的生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究。多項(xiàng)研究表明，四環(huán)素類抗生素可能通過(guò)抑制葉綠體合酶的活性，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，影響植物發(fā)芽率和根的生長(zhǎng)，這與四環(huán)素對(duì)微藻的毒性研究結(jié)果相似。葉綠素含量減少，則藻細(xì)胞的光合作用強(qiáng)度下降，即新陳代謝強(qiáng)度減弱，細(xì)胞的繁殖能力下降。L1）。L1， LOEC 值為 mg 四環(huán)素類藥物對(duì)微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成最終造成對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制。一般情況下，四環(huán)素對(duì)原核生物（如藍(lán)藻）的毒性高于單細(xì)胞真核生物（如微藻類 ），單細(xì)胞生物對(duì)抗生素的敏感度則高于多細(xì)胞生物，這也與設(shè)計(jì)生產(chǎn)四環(huán)素類藥物的初衷一致。尤其是隨著集約化現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素類藥物構(gòu)成對(duì)環(huán)境以及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 3 的威脅日益暴露。而在荷蘭，有研究推測(cè)，如果將荷蘭在飼料中添加的所有促生長(zhǎng)劑分散在 200 萬(wàn) hm2的耕地上，那么每平方米的耕地上可能發(fā)現(xiàn) 130 mg 抗生素及其代謝物，與之對(duì)應(yīng)的是每千克干土為 mg。k1。 Liguoro 等 ［ 7］ 以 60mg 四環(huán)素類抗生素在進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后，由于氧化、還原、水解以及共軛接合作用，這些藥物形態(tài)的改變使其理化性質(zhì)和生態(tài)毒性發(fā)生變化，但研究顯示，隨動(dòng)物體排出以后，代謝物質(zhì)可能會(huì)恢復(fù)為其母體化合物 ［ 4］ 。 四環(huán)素類抗生素 的污染現(xiàn)狀 四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，可分為天然品和四環(huán)素類抗生素，一般通過(guò)與核蛋白體的 30S 亞單位結(jié)合，阻止氨?；?tRNA 同核蛋白體結(jié)合產(chǎn)生藥理作用，起到抑菌、殺菌作用。到 20xx 年，全國(guó) 畜禽糞便的排放量將達(dá) 45 億噸。 此外獸藥抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中以亞治療劑量長(zhǎng)期添加于動(dòng)物飼料，起到刺激動(dòng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)增產(chǎn)的作用。超過(guò) 90%的人類使用的抗生素以活性形式排出體外，這些抗生素接著出現(xiàn)在我們的飲用水中，不僅會(huì)進(jìn)入人體干擾正常的菌群平衡，而且還可以通過(guò)殺滅周圍環(huán)境中的有益菌來(lái)破壞生態(tài)平衡。據(jù)報(bào)道 , 在畜禽生產(chǎn)中使用的抗生素有 30%~90%以母體化合物形式隨畜禽糞便排出，某些抗生素能以母體化合物形式排出高達(dá) 95%［ 2］ 。 一般來(lái)說(shuō)，抗生素包括人用和獸用兩類。 Inhibit。 為今后的研究方向進(jìn)行了探計(jì)，旨在為其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供有價(jià)值的參考。本文介紹了四環(huán)素 類抗生素的污染現(xiàn)狀以及生態(tài)毒性。 Wasberg, M., Electrochemical detection of microcystins, cyanobacterial peptide hepatotoxins, following highperformance liquid. 六、進(jìn)度安排：（設(shè)計(jì)或論文各階段的要求，時(shí)間安排） 1～ 4 周： 文獻(xiàn)綜述撰寫(xiě)，英文翻譯。 Beasley, V. R.。 Oka, H.。 Fanali, C.。 Boynton, A. L., Characterization of natural toxins with inhibitory activity against serine thereonine protein phosphatases. Toxicon 1994, 32 (3), 339350. 8. Bogtalli, S.。 Carmichael, W. W.。 Yoshizawa, S.。 Hooser, S. B.。 FN SPON Routledge: New York, 1999. 2. Galey, F. D.。 四、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）應(yīng)完成的具體工作 實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定培養(yǎng)藍(lán)藻細(xì)胞； 藍(lán)藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制及 EC50 計(jì)算； 蛋白含量檢測(cè)； 抗生素在藻液體系中的含量變化檢測(cè)。 急性毒性實(shí)驗(yàn)及蛋白含量檢測(cè)條件具備。1176。 化合物的染毒及抗生素殘留分析。上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 畢業(yè) 論文 題 目： 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 專 業(yè)： 環(huán)境工程 班 級(jí)： 09107411 學(xué)生姓名： 倪 吉 學(xué)生學(xué)號(hào)： 0810741116 指導(dǎo)老師： 葉 璟 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 20xx 年 5 月 30 日 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書(shū) 題目：四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 學(xué)生姓名：倪吉 學(xué)號(hào)： 0810741116 專業(yè)：環(huán)境工程 任務(wù)起止日期： 20xx 年 12 月 25 日至 20xx 年 5 月 30 日 共 16 周 一、 課題的任務(wù)內(nèi)容： 了解并掌握抗生素四環(huán)素的化學(xué)性質(zhì)及生物有效性。 二、 原始條件及數(shù)據(jù)： 銅綠微囊藻（ Microcystis aeruginosa） FACHB 905 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生所（武漢，中國(guó)）。C，光強(qiáng) 40μmol/m2?S，濕度 60%，白天 /黑夜 =12h/12h。 抗生素液相檢測(cè)方法基本建立。 數(shù)據(jù)分析，論文撰寫(xiě)。 Beasley, V. R.。 Haschek, W. M., Bluegreen algae (Microcystis aeruginosa) hepatotoxicosis in dairy cows. Am J Vet Res 1987, 48 (9), 141520. 3. Carmichael, W. W., Cyanobacteria secondary metabolitesThe cyantoxins. J. Appl. Bacteriol. 1992, 72 (6), 445459. 4. WHO, Guidelines for drinkingwater quality, 2nd ed.。