【正文】 見(jiàn)下圖：橫坐標(biāo)為 680 nm波長(zhǎng)下， 銅綠微囊藻 的吸光度，縱坐標(biāo)為 藻 細(xì)胞 生物量 （單位 105個(gè) /mL）。使用高效液相色譜儀分別測(cè)定 0、 2 4 7 9 1 144 小時(shí)各藻樣四環(huán)素的峰面積，繪制藻樣中四環(huán)素在控制組和各濃度梯度下的降解曲線。 （ 2） 高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在 15～ 30 分鐘 ， 有些樣品甚至在 5 分鐘內(nèi)即可完成 ， 一般小于 1 小時(shí)。編號(hào)為 1 和 2 的 兩 瓶藻樣作為控制樣參照?？捡R斯亮藍(lán) G250 試劑呈色反應(yīng)顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測(cè)試蛋白質(zhì)量在 1 μg 左右。 四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻的抑制率測(cè)定 生長(zhǎng)阻礙率： 00 100tKKK? ??? （ 32） 式中 ： K0—— 空白樣吸光度 ； Kt—— t 時(shí)刻吸光度 圖 31 測(cè)定銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 16 銅綠微囊藻 pH變化規(guī)律 將 16 個(gè) 50 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL。 因此：每 ml 菌懸液中含有細(xì)胞數(shù) = 每個(gè) 中 格中細(xì)胞平均數(shù)（ N） 系數(shù)（ K） 菌液稀釋倍數(shù)（ d） 。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 14 3. 實(shí)驗(yàn) 方案與方法 四環(huán)素儲(chǔ)備液的配置 使用分析天平秤取 的四環(huán)素，加入經(jīng)滅菌烘干過(guò)的 10 mL 容量瓶中，并使用1000 μL的移液槍移取 10 mL 娃哈哈純凈水 配置成為濃度為 1000 mg/L的四環(huán)素 儲(chǔ)備液 10 mL。多項(xiàng)研究表明，四環(huán)素類(lèi)抗生素可能通過(guò)抑制葉綠體合酶的活性，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，影響植物發(fā)芽率和根的生長(zhǎng)，這與四環(huán)素對(duì)微藻的毒性研究結(jié)果相似。培養(yǎng)方法是 使用上述 250 mL 或 500 mL 的經(jīng)過(guò)藻液接種的三角燒瓶。將其余滅菌后的器皿放入 電熱鼓風(fēng)干燥箱中，在70?C 的環(huán)境下鼓風(fēng)干燥 2 小時(shí)。隨后領(lǐng)取一潔凈 1 L 玻璃瓶，按上表 91～ 96 配置微量元素 A5 一瓶。2H2O g/L 8 無(wú)水碳酸鈉 Na2CO3 g/L 9 A5 1 ml/L 4ml 91 硼酸 H3BO3 g/L 92 氯化錳 MnCl26H2O。7H2O、 CaCl2 藻類(lèi)是最簡(jiǎn)單的光合營(yíng)養(yǎng)有機(jī)體，種類(lèi)繁多，分布很廣，是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者。劉天富等測(cè)得三門(mén)峽市飲用水調(diào)蓄池中微囊藻毒素在 ～ ng/L 之間，出水廠為 ～ ng/L。徐海濱等對(duì)江西鄱陽(yáng)湖的調(diào)查顯示，水體微囊藻毒素最大為 pg/mL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)魚(yú)體內(nèi)有素積累。 微囊藻毒素的污染現(xiàn)狀 微囊藻毒素的污染現(xiàn)狀 藍(lán)藻分布廣泛，全球各大洲范圍內(nèi)有多達(dá)六十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道過(guò)藍(lán)藻水華的發(fā)生，存在于藍(lán)藻細(xì)胞中的微囊藻毒素，隨著細(xì)胞的衰老、死亡或溶解會(huì)釋放到水體中，因此全世界很多地區(qū)、國(guó)家的天然水體， 甚至飲用水中都檢測(cè)到了微囊藻毒素。溫度低于 15?C 時(shí)其生長(zhǎng)會(huì)被顯著的抑制。色球藻綱藻體為單細(xì)胞體或群體；藻殖段綱藻體為絲狀體，有藻殖段。其他如放線菌屬、炭疽桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、梭狀芽孢桿 菌、奴卡菌屬等對(duì)四環(huán)素敏感。 圖 11 四環(huán)素結(jié)構(gòu)式 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，各種 立克次氏體 、螺旋體、大型病毒等有抑制作用。在水中溶解，在 乙醇 中略溶，在 氯仿 或 乙醚 中不溶。 Ferreira 等以硝化纖維過(guò)濾的大西洋海水中的鹵蟲(chóng)為研究對(duì)象，通過(guò) 24 h 和 48 h 的鹵蟲(chóng)死亡數(shù)計(jì)算死亡率，利用概率值分析法計(jì)算半致死濃度，結(jié)果顯示，四環(huán)素 24 h 和 48h IC50分別為 mgL1時(shí)，土霉素對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)所測(cè)定的抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻藻都有不同程度的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（ EC50）值處于 mg/L 水平，同時(shí)，抗菌藥對(duì)藻類(lèi)的急性毒性呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，并且銅綠微囊藻 對(duì)抗菌藥較為敏感 ［ 21］ 。L1）和 mgkg1［ 14］ 。即由于抗生素環(huán)境濃度預(yù)測(cè)模型的不成熟，以及抗生素環(huán)境分布的變異性，局部地區(qū)的濃度真實(shí)值可能遠(yuǎn)大于預(yù)測(cè)平均值 ［ 9］ 。d1土霉素的量對(duì) 50 頭農(nóng)場(chǎng)喂養(yǎng)的西門(mén)塔爾牛進(jìn)行 5 d 口服實(shí)驗(yàn)，此后對(duì)其糞肥中土霉素含量進(jìn)行測(cè)定。 1957 年，去甲環(huán)素被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)這些抗生素進(jìn)行降解研究，人們發(fā)現(xiàn)它們具有極為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有 4個(gè)環(huán)線形相連構(gòu)成主體骨架，從此“四環(huán)素”被看成一類(lèi)新的抗生素。然而，研究表明，抗生素藥物只有 15%可被吸收利用，大約 85%未被代謝而被直接排放至環(huán)境中。 北京大學(xué)臨床藥理研究所肖永紅教授等專家調(diào)查推算，中國(guó)每年生產(chǎn)抗生素原料 21萬(wàn)噸，有 萬(wàn)噸抗生素用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，占年總產(chǎn)量的 %。除從微生物培養(yǎng)液提取外，有些抗生素已能通過(guò)人工合成或半合成得到。結(jié)果表明： 1 mg/L 的四環(huán)素能夠刺激銅綠微囊藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，而 銅綠微囊藻在長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度 四環(huán)素 時(shí) 其 生長(zhǎng)明顯受到抑制 。 Kincaid, B.。 Matsuura, K.。 Codispoti, B. A.。 addendum to Vol. 2, Health criteria and other supporting information. Geneva, Switzerland, 1998. 5. Mackintosh, C.。 五、查閱文獻(xiàn)要求及主要的參考文獻(xiàn) 1. Chorus, I.。 急性毒性實(shí)驗(yàn)參照 OECD 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 了解藻類(lèi)的一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法。置于 RXZ 智能人工氣候箱，溫度28177。 掌握數(shù)據(jù)分析基本方法。 Kleppe, G.。 Furusawa, M.。 Corcia, A. D.。 Dahlem, A. M.。 指導(dǎo)老師： 葉璟 審核意見(jiàn)： 教研室主任： 曹萍 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 摘要 ： 四環(huán)素 類(lèi)抗生素 是 目前 使用最廣泛、用量最大的抗生素種類(lèi)之一 , 其在環(huán)境中的大量殘留帶來(lái)了潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。 Acute toxicity。 含有抗生素的畜禽糞便的土地利用是土壤中抗生素類(lèi)污染物的主要來(lái)源。因此，對(duì)于含有抗 生素的醫(yī)院污水或城市生活污水，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)處理，只要實(shí)施排放，均可以導(dǎo)致對(duì)地表水、地下水以及農(nóng)田土壤環(huán)境的污染。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用，是抗生素進(jìn)入水環(huán)境的一個(gè)重要途徑 ［ 3］ 。有報(bào)道顯示：土霉素在綿羊糞便中殘留 21%，金霉素在小公牛糞便中殘留 17%~75%［ 6］ 。k1的四環(huán)素 ［ 8］ 。 四環(huán)素類(lèi)抗生素的生態(tài)毒性 四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)微生物的生態(tài)毒性 由于四環(huán)素類(lèi)抗生素主要用來(lái)抑制菌類(lèi)物質(zhì)的生長(zhǎng)發(fā)育，因此近年來(lái)研究者們對(duì)于四環(huán)素對(duì)細(xì)菌、真菌和微藻等的生態(tài)毒性做了廣泛研究。L1溶液中扁藻的生長(zhǎng)抑制顯著， NOEC 值為 mgL1［ 19］ ，土霉素能抑制等鞭金藻葉綠素含量的生成，并且藥量越大抑制作用越強(qiáng)；對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的生成起促進(jìn)作用，藥量越大則類(lèi)胡蘿卜素含量越多。當(dāng)土霉 素濃度升高時(shí)，紫花苜蓿的葉子出現(xiàn)變黃現(xiàn)象，四環(huán)素類(lèi)抗生素對(duì)紫花苜蓿的毒性可能是由于四環(huán)素與葉綠體合酶結(jié)構(gòu)相似，因此四環(huán)素抑制了葉綠體翻譯活性及葉綠體合酶的活性。結(jié)果表明，土霉素的 48h EC50超過(guò) 1000 mgL1和 828 mg 密度： g/cm3； 沸點(diǎn)： 176。 四環(huán)素 的藥理毒理 四環(huán)素為廣譜抑菌劑，高濃度時(shí)具殺菌作用。 藍(lán)藻 、銅綠微囊藻 藍(lán)藻概述 藍(lán)藻和具原核的細(xì)菌等一起，單立為原核生物界。 原生質(zhì)體 的顏色是淺藍(lán)綠色，但因細(xì)胞中具有充滿空氣的 囊泡 在光下可能呈暗色，這是 光學(xué)顯微鏡 下微囊藻的鑒別特征之一。野生動(dòng)物、家畜及家禽飲用了含有毒藻及藻毒的水后，會(huì)引起中毒甚至死亡，人飲用后也會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，因此當(dāng)作為飲用水源的湖泊、水庫(kù)和河流中出現(xiàn)藍(lán)藻水華時(shí)，則應(yīng) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 7 引起注意。此外，長(zhǎng)江、黃河、松花江中下游等主要河流以及鄱陽(yáng)湖、武漢東湖、上海淀山湖等幾大淡水湖泊、水庫(kù)中也都相繼發(fā)生了不同程度的藍(lán)藻水華污染并檢測(cè)到了 MC 的存在，目前對(duì)我國(guó)南北幾個(gè)省市各水體都有不同程度的 MC 污染，其中以溝塘水、河水和水庫(kù)水最為嚴(yán)重。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 8 飲用水的微囊藻毒素污染 除天然水體及水庫(kù)源水中普遍檢測(cè)出 MC 外，飲用水也存在 MC 污染。 這 對(duì) 四環(huán)素 類(lèi)抗生素 的應(yīng)用，評(píng)價(jià)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，減少毒害是 十分 重要的 。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 9 2. 實(shí)驗(yàn)條件及預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)條件 實(shí)驗(yàn)儀器 BXM30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠） JY962N 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司） RJTGL16B 高速離心機(jī)（無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司） FA1004 電子天平（上海?？惦娮觾x器廠） PHS3CpH 計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司） 超聲儀（上海寧商超聲儀器有限公司） TU1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司） SPXGB150 光照培養(yǎng)箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司） BCD108S（康佳冷藏冷凍箱） 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司） Dragonlab TopPette 移液槍 1000 μL、 200 μL LabTech 高效液相色譜儀 UV600 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器（北京萊伯泰科儀器有限公司） 針頭過(guò)濾器（郭店桃園醫(yī)療化工儀器廠，海寧市） 實(shí)驗(yàn)材料 10 mL、 25 mL 容量瓶各 1 個(gè) 50 mL、 100 mL 三角燒瓶 各 15 個(gè) 250 mL、 500 mL 三角燒瓶各 2 個(gè) 10 mL 試管 20 支 100 mL 燒杯 4 個(gè) 、 250 mL、 500 ml 燒杯各一個(gè) 50 mL、 100 mL、 250 mL 量筒各 1 個(gè) 4 L 培養(yǎng)液儲(chǔ)備瓶 1 個(gè) 石英比色皿 2 對(duì) 100 μL微量進(jìn)樣針 1 支 200 μL、 1000 μL移液槍頭若干 mL、 mL 離心管若干 一次性無(wú)菌注射器若干 稱量紙、擦鏡紙若干 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 10 圖 21 實(shí)驗(yàn)室部分儀器設(shè)備 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 11 實(shí)驗(yàn)藥品 純水、 無(wú)水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。7H2O、 Na2MoO47H2O g/L 4 二水合氯化鈣 CaCl26H2O g/L 上表為 BG11 培養(yǎng)基配置的具體方法。 高壓蒸氣滅菌法是利用適當(dāng)溫度和壓力的飽和水蒸氣加熱殺滅微生物的一種方法。上午接種可以吸取上浮的運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)的藻細(xì)胞做藻種，棄去底部沉淀的藻細(xì)胞，起到擇優(yōu)的作用。 白天黑夜 時(shí)間 比為 12h:12h。 在 硬件上，學(xué)校測(cè)試中心擁有本項(xiàng)目所需的大型設(shè)備： 紫外 可見(jiàn)分光光度計(jì)、細(xì)胞破碎儀、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、電子顯微鏡、滅菌鍋 等。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為 mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為 mm3，每個(gè)小方格的體積為 1/4000 mm3。 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 將 16 個(gè) 50 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL。由于蛋白質(zhì) —— 考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在 595 nm 處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在 465 nm 處的光吸收，因此，可大大地提高蛋白質(zhì)的測(cè)定靈敏度。用分光光度計(jì)比色測(cè)定吸光值 A595nm。這種互作用力通常是 分析物 及 分析管柱 之間的一種非共價(jià)性質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)采用反向分配色譜法，使用 C18 色譜柱，采用 15%:85%（乙腈（色譜純）：檸檬酸溶液 pH 約 ） 作為流動(dòng)相。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 20 4. 結(jié)果與討論 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得藻液吸光度，并使用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡計(jì)量相對(duì)應(yīng)吸光度下銅綠微囊藻細(xì)胞的個(gè)數(shù)，匯總兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 并 篩選 。 y = + R178。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按濃度從小到大依次進(jìn)樣，分別求出儀器的檢測(cè)限和四環(huán)素液相的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （ 4） 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá) ng， 進(jìn)樣量在 μL數(shù)量級(jí)。測(cè)定吸光度時(shí)，先從 100 mL 三角燒瓶中取出 30 mL，移至燒杯，在細(xì)胞破碎儀下破碎 10 分鐘（破碎 3 秒，停 3 秒），隨后取經(jīng)破碎的藻液于離心機(jī)下離心（ 3000r/m），取離心后上清液 1 mL 于 10 mL 試管中加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)，震蕩均勻，并靜置 20 分鐘，隨后在 595 nm 下測(cè)定吸光度。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：