【正文】 ................................................................................ 14 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 15 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 ................................................................................... 15 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 16 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ........................................................................... 16 實(shí)驗(yàn)原理 ............................................................................................................. 16 試劑配制 ............................................................................................................. 16 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 16 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠 微囊藻液中的降解 ............................................... 17 實(shí)驗(yàn)原理 ............................................................................................................. 17 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn) ............................................................................................................. 17 實(shí)驗(yàn)方法 ............................................................................................................. 18 4. 結(jié)果與討論 ............................................................................................................................ 20 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)與吸光度的關(guān)系 ........................................................................... 20 生長(zhǎng)曲線與抑制率 ....................................................................................................... 20 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 25 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ........................................................................... 26 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 ............................................... 28 標(biāo)準(zhǔn)曲線 ............................................................................................................. 28 降解曲線 ............................................................................................................. 31 5. 結(jié)論 ........................................................................................................................................ 37 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 1 1. 引言（緒論） 抗生素的污染現(xiàn)狀 抗生素是一類生物（主要是真菌、放線菌或細(xì)菌等微生物）在其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有殺滅或抑制他種生物（主要是微生物）作用的化學(xué)物質(zhì)。目前大部分醫(yī)院對(duì)藥物的使用仍以抗生素的處方為主，這就造成了醫(yī)療系統(tǒng)強(qiáng)加給生病病人抗生素的濫用；另有一些家庭自醫(yī)的人群，隨意到藥店擅自購(gòu)買抗生素服用。 因此對(duì)該問(wèn)題更應(yīng)引起重視。同時(shí)，農(nóng)業(yè)濫用抗生素正在導(dǎo)致超級(jí)病毒的傳播，非傳染性疾病和免疫性疾病大大增加了，人類的免疫系統(tǒng)正在衰退，而抗生素的濫用也是造成新型疾病增加的原因之一。目前在全球范圍內(nèi)幾乎所有地區(qū)都采用抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)增加產(chǎn)量、提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。如此大量的畜禽糞便排放，是構(gòu)成我國(guó)抗生素面源污染的主要原因之一。 20 世紀(jì)40 年代末、 50 年代初，金霉素、土霉素和四環(huán)素相繼從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到，這 3種四環(huán)素類抗生素都顯示了完全的交叉抗性，有著相似的、廣泛的抗菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性菌、支原體、立克次體和衣原體之類的微生物都有活性。 在密集型養(yǎng)魚場(chǎng)，最終有 70%~80%藥物流入環(huán)境之中 ［ 5］ 。kg1 在德國(guó)農(nóng)業(yè)土壤和草原土壤的 0~10cm 土壤表層中分別檢測(cè)到含有 4 mg實(shí)際上，四環(huán)素類抗生素的分布不可能如此均一，因此可以預(yù)測(cè)，部分地區(qū)的局部濃度要高于平均值。雖然，人們對(duì)藥物及個(gè)人防護(hù)品污染物（ PPCPs）等新型污 染物造成的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題給予了越來(lái)越多的關(guān)注，而作為 PPCPs 這一大類污染物中的四環(huán)素類藥物的環(huán)境污染方面的研究還相對(duì)較少 ［ 10～ 13］ ，尤其是其污染機(jī)理及生態(tài)毒性的研究還處于研究的起始階段。例如，通過(guò)對(duì)費(fèi)氏弧菌的長(zhǎng)達(dá) 24h毒性研究表明，四環(huán)素的 EC50值為 mg Ferreira 等依據(jù) OECD201 準(zhǔn)則《藻類生長(zhǎng)抑制測(cè)試》（ OECD， 1984）研究了四環(huán)素對(duì)扁藻的生長(zhǎng)抑制情況。L1， 72 h 及 96h IC50值分別為 （ 95%置信區(qū)間為： ~ mg 此外，四環(huán)素類藥物能夠抑制銅綠微囊藻和綠藻的蛋白質(zhì)合成。 ［ 20］ 王志強(qiáng)運(yùn)用藻類抑制試驗(yàn)，以光密度法確定藻細(xì)胞的生物量，研究了獸醫(yī)臨床 12 種常用的抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻的急性毒性。四環(huán)素類藥物對(duì)植物根的毒性較大，高濃度時(shí)顯著抑制初生根的生長(zhǎng)，這可能與四環(huán)素在植物根部的蓄積量有關(guān)，在根部蓄積量最多，因此表現(xiàn)出對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用最為顯著。研究表明，當(dāng)濃度高于 mmol Wollenberger 等根據(jù)水蚤急性毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議（ ISO， 1989b）測(cè)定了包括四環(huán)素類抗生素在內(nèi)的 9 種抗生素對(duì)水蚤的急性毒性，并根據(jù) 48 h 急性毒性試驗(yàn) EC50值進(jìn)行排序。L1，在每個(gè)濃度均觀察 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 5 到對(duì)水蚤生殖能力的影響，其影響較急性毒性水平低一個(gè)數(shù)量級(jí)。L1（ 95%置信區(qū)間為： ~1129 mg 四環(huán)素的 理化性質(zhì) 和藥理毒理 四環(huán)素 的理化性質(zhì) 該鹽酸鹽為 黃色 結(jié)晶性粉末；無(wú)臭，味苦；有引濕性；遇光色漸變深，在 堿性 溶液中易破壞失效。C （分解）。C。但有嘔吐、惡心、腹瀉等 副作用 。四環(huán)素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用優(yōu)于 革蘭陰性菌 ，但 腸球菌屬 對(duì)其耐藥。多年來(lái)由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見病原菌包括葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌及腸桿菌屬等革蘭陰性桿菌對(duì)四環(huán)素多數(shù)耐藥，并且，同類品種之間存在交叉耐藥。藍(lán)藻門分為兩綱：色球藻綱和藻殖段綱。銅綠微囊藻細(xì)胞大小僅有 3 至 8 微米，且其外沒有鞘包覆。 銅綠微囊藻較偏好高溫，但毒性與最高生長(zhǎng)率不一定有關(guān)聯(lián)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中， 32?C具有最高的生長(zhǎng)率，但毒性最強(qiáng)的溫度是 20?C。 藻類水華 在許多富營(yíng)養(yǎng)化水體中，由于藍(lán)藻的增殖，常常會(huì)形成大量的水華，這不但影響水質(zhì)，且在某些時(shí)期具毒性。銅綠微囊藻的毒素是多膚類的肝毒素，主要引起動(dòng)物肝臟淤血腫大，并對(duì)肝細(xì)胞有破壞作用。 天然及水庫(kù)水體的微囊藻毒素污染 我國(guó)是一個(gè)湖泊眾多的國(guó)家， 20 世紀(jì) 90 年代以來(lái)，藍(lán)藻水華暴發(fā)的面積、強(qiáng)度以及藻毒素含量均在大幅度增長(zhǎng)，由此帶來(lái)的環(huán)境和生物安全問(wèn)題日益引起關(guān)注。 Shen等 ［ 28］ 報(bào)道太湖梅梁灣的微囊藻毒素隨時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)鹽水平的不同有很大差異，胞內(nèi)毒素最高可達(dá) μg/g干藻。廣東省典型供水水庫(kù)和淡水湖泊微囊藻毒素分布廣泛，毒素組成以 MCRR 為主，水庫(kù)微囊藻毒素含量在 0～ μg/L。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明，包括上海、廈門、無(wú)錫及昆山在內(nèi)的部分城市自來(lái)水廠出水樣品中能檢測(cè)出 MC，部分樣品最大濃度接近甚至超過(guò)安全限值（ 1μg/L）。 而 關(guān)于四環(huán)素的急性毒性效應(yīng)的研究還非常有限，四環(huán)素 對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者 —— 藻類 的 毒性的研究 尚不夠多 。 課題研究的內(nèi)容 急性毒性是指 機(jī)體（人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物）一次（或 24 小時(shí)內(nèi)多次）接觸外來(lái)化合物之后所引起的中毒效應(yīng)，甚至引起死亡。所以，通過(guò)測(cè)定藻類的數(shù)量就可以評(píng)價(jià)有毒有害污染物對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響及對(duì)整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的綜合環(huán)境效應(yīng)。3H2O、 MgSO42H2O、 Na2CO H3BO MnCl25H2O、 Co(NO3)2 表 21 配置 BG11培養(yǎng)液 編號(hào) 成分 化學(xué)式 單位含量 含量 1 硝酸鈉 NaNO3 g/L 2 磷酸氫二鉀 K2HPO4H2O g/L 6 檸檬酸鐵銨 C12H22FeN3O14 g/L 7 乙二胺四乙酸二鈉 C10H14N2O8Na22H2O g/L 95 硫酸銅 CuSO4隨后分別按上表所示在 FA1004 電子天平上稱取 硝酸鈉、磷酸氫二鉀 、硫酸鎂 、二水合氯化鈣 、檸檬酸 、檸檬酸鐵銨 、乙二胺四乙酸二鈉 、無(wú)水碳酸鈉 。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 12 高壓蒸氣 滅菌 滅菌是指用物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物以及 芽孢 ，使之達(dá)到無(wú)菌保障水平。 滅菌條件為在 121?C， MPa 下滅菌 30 分鐘，待滅菌鍋壓力指示為 0 MPa 時(shí)，將滅菌后的培養(yǎng)液取出 置于避光處 存放 。 銅綠微囊藻的 接種 銅綠微囊藻 FACHB 905 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生所（武漢，中國(guó)）。 銅綠微囊藻的 培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為 SPXGB150 人工智能氣候箱。?C，光照在 20xx～ 4000 Lx 連續(xù)靜止培養(yǎng)。四環(huán)素類藥物對(duì)微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成最終造成對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制。 就 技術(shù) 而言， 實(shí)驗(yàn)室對(duì) 本項(xiàng)目開展了前期研究，結(jié)果表明本項(xiàng)目在科學(xué)上和技術(shù)上是可行的。這些條件為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成 25 個(gè)大方格（大方格之間用雙線分開），而每個(gè)大方格又分成 16 個(gè)小方格 共計(jì) 由 400 個(gè)小方格組成。 已知： 1 cm3體積 =10 mm10 mm10 mm= 1000 mm3 所以： mm3體積應(yīng)含有 中 方格數(shù)為 25，即系數(shù) K=105 。進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)，第一次試驗(yàn)，將原液分別稀釋 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍和 50 倍，測(cè)定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機(jī)選取 25 個(gè)中格中的 5 個(gè)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并換算計(jì)算藻密度，第二次實(shí)驗(yàn)，分別將原藻樣稀釋 20 倍、 30 倍、 40 倍、 50 倍、 60 倍和 100 倍，測(cè)定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機(jī)選取 25 個(gè)中格中的 9 個(gè)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并換算計(jì)算藻密度。分別測(cè)定 2 47 9 1 144 小時(shí)各藻樣的吸光度，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的生長(zhǎng)曲線，并求 EC(50,96h)。 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán) G250 是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍(lán)色染料，在 465 nm 處有最大吸收值。利用溶液顏