【正文】 ................................................................................ 14 實驗方法 ............................................................................................................. 15 銅綠微囊藻生長曲線及抑制率 ................................................................................... 15 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 16 考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量 ........................................................................... 16 實驗原理 ............................................................................................................. 16 試劑配制 ............................................................................................................. 16 實驗方法 ............................................................................................................. 16 高效液相色譜檢測四環(huán)素在銅綠 微囊藻液中的降解 ............................................... 17 實驗原理 ............................................................................................................. 17 實驗特點 ............................................................................................................. 17 實驗方法 ............................................................................................................. 18 4. 結果與討論 ............................................................................................................................ 20 銅綠微囊藻細胞數(shù)與吸光度的關系 ........................................................................... 20 生長曲線與抑制率 ....................................................................................................... 20 銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 ............................................................................................ 25 考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量 ........................................................................... 26 高效液相色譜檢測四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 ............................................... 28 標準曲線 ............................................................................................................. 28 降解曲線 ............................................................................................................. 31 5. 結論 ........................................................................................................................................ 37 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 1 1. 引言（緒論） 抗生素的污染現(xiàn)狀 抗生素是一類生物（主要是真菌、放線菌或細菌等微生物）在其代謝過程中產(chǎn)生的具有殺滅或抑制他種生物（主要是微生物）作用的化學物質。目前大部分醫(yī)院對藥物的使用仍以抗生素的處方為主，這就造成了醫(yī)療系統(tǒng)強加給生病病人抗生素的濫用；另有一些家庭自醫(yī)的人群，隨意到藥店擅自購買抗生素服用。 因此對該問題更應引起重視。同時，農(nóng)業(yè)濫用抗生素正在導致超級病毒的傳播，非傳染性疾病和免疫性疾病大大增加了，人類的免疫系統(tǒng)正在衰退，而抗生素的濫用也是造成新型疾病增加的原因之一。目前在全球范圍內幾乎所有地區(qū)都采用抗生素來實現(xiàn)增加產(chǎn)量、提高經(jīng)濟效益的目的。如此大量的畜禽糞便排放，是構成我國抗生素面源污染的主要原因之一。 20 世紀40 年代末、 50 年代初，金霉素、土霉素和四環(huán)素相繼從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到，這 3種四環(huán)素類抗生素都顯示了完全的交叉抗性，有著相似的、廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌、支原體、立克次體和衣原體之類的微生物都有活性。 在密集型養(yǎng)魚場，最終有 70%~80%藥物流入環(huán)境之中 ［ 5］ 。kg1 在德國農(nóng)業(yè)土壤和草原土壤的 0~10cm 土壤表層中分別檢測到含有 4 mg實際上，四環(huán)素類抗生素的分布不可能如此均一，因此可以預測，部分地區(qū)的局部濃度要高于平均值。雖然，人們對藥物及個人防護品污染物（ PPCPs）等新型污 染物造成的生態(tài)環(huán)境問題給予了越來越多的關注，而作為 PPCPs 這一大類污染物中的四環(huán)素類藥物的環(huán)境污染方面的研究還相對較少 ［ 10～ 13］ ，尤其是其污染機理及生態(tài)毒性的研究還處于研究的起始階段。例如，通過對費氏弧菌的長達 24h毒性研究表明，四環(huán)素的 EC50值為 mg Ferreira 等依據(jù) OECD201 準則《藻類生長抑制測試》（ OECD， 1984）研究了四環(huán)素對扁藻的生長抑制情況。L1， 72 h 及 96h IC50值分別為 （ 95%置信區(qū)間為： ~ mg 此外，四環(huán)素類藥物能夠抑制銅綠微囊藻和綠藻的蛋白質合成。 ［ 20］ 王志強運用藻類抑制試驗，以光密度法確定藻細胞的生物量，研究了獸醫(yī)臨床 12 種常用的抗菌藥對銅綠微囊藻的急性毒性。四環(huán)素類藥物對植物根的毒性較大，高濃度時顯著抑制初生根的生長，這可能與四環(huán)素在植物根部的蓄積量有關，在根部蓄積量最多，因此表現(xiàn)出對根生長的抑制作用最為顯著。研究表明，當濃度高于 mmol Wollenberger 等根據(jù)水蚤急性毒性試驗的標準協(xié)議（ ISO， 1989b）測定了包括四環(huán)素類抗生素在內的 9 種抗生素對水蚤的急性毒性，并根據(jù) 48 h 急性毒性試驗 EC50值進行排序。L1，在每個濃度均觀察 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 5 到對水蚤生殖能力的影響，其影響較急性毒性水平低一個數(shù)量級。L1（ 95%置信區(qū)間為： ~1129 mg 四環(huán)素的 理化性質 和藥理毒理 四環(huán)素 的理化性質 該鹽酸鹽為 黃色 結晶性粉末；無臭，味苦；有引濕性；遇光色漸變深，在 堿性 溶液中易破壞失效。C （分解）。C。但有嘔吐、惡心、腹瀉等 副作用 。四環(huán)素對革蘭陽性菌的作用優(yōu)于 革蘭陰性菌 ，但 腸球菌屬 對其耐藥。多年來由于四環(huán)素類的廣泛應用，臨床常見病原菌包括葡萄球菌等革蘭陽性菌及腸桿菌屬等革蘭陰性桿菌對四環(huán)素多數(shù)耐藥，并且，同類品種之間存在交叉耐藥。藍藻門分為兩綱：色球藻綱和藻殖段綱。銅綠微囊藻細胞大小僅有 3 至 8 微米，且其外沒有鞘包覆。 銅綠微囊藻較偏好高溫，但毒性與最高生長率不一定有關聯(lián)，在實驗室培養(yǎng)中， 32?C具有最高的生長率，但毒性最強的溫度是 20?C。 藻類水華 在許多富營養(yǎng)化水體中，由于藍藻的增殖，常常會形成大量的水華，這不但影響水質，且在某些時期具毒性。銅綠微囊藻的毒素是多膚類的肝毒素，主要引起動物肝臟淤血腫大，并對肝細胞有破壞作用。 天然及水庫水體的微囊藻毒素污染 我國是一個湖泊眾多的國家， 20 世紀 90 年代以來，藍藻水華暴發(fā)的面積、強度以及藻毒素含量均在大幅度增長，由此帶來的環(huán)境和生物安全問題日益引起關注。 Shen等 ［ 28］ 報道太湖梅梁灣的微囊藻毒素隨時間和營養(yǎng)鹽水平的不同有很大差異，胞內毒素最高可達 μg/g干藻。廣東省典型供水水庫和淡水湖泊微囊藻毒素分布廣泛，毒素組成以 MCRR 為主，水庫微囊藻毒素含量在 0～ μg/L。國內相關研究表明，包括上海、廈門、無錫及昆山在內的部分城市自來水廠出水樣品中能檢測出 MC，部分樣品最大濃度接近甚至超過安全限值（ 1μg/L）。 而 關于四環(huán)素的急性毒性效應的研究還非常有限，四環(huán)素 對生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者 —— 藻類 的 毒性的研究 尚不夠多 。 課題研究的內容 急性毒性是指 機體（人或實驗動物）一次（或 24 小時內多次）接觸外來化合物之后所引起的中毒效應，甚至引起死亡。所以，通過測定藻類的數(shù)量就可以評價有毒有害污染物對藻類生長的影響及對整個水生生態(tài)系統(tǒng)的綜合環(huán)境效應。3H2O、 MgSO42H2O、 Na2CO H3BO MnCl25H2O、 Co(NO3)2 表 21 配置 BG11培養(yǎng)液 編號 成分 化學式 單位含量 含量 1 硝酸鈉 NaNO3 g/L 2 磷酸氫二鉀 K2HPO4H2O g/L 6 檸檬酸鐵銨 C12H22FeN3O14 g/L 7 乙二胺四乙酸二鈉 C10H14N2O8Na22H2O g/L 95 硫酸銅 CuSO4隨后分別按上表所示在 FA1004 電子天平上稱取 硝酸鈉、磷酸氫二鉀 、硫酸鎂 、二水合氯化鈣 、檸檬酸 、檸檬酸鐵銨 、乙二胺四乙酸二鈉 、無水碳酸鈉 。 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 12 高壓蒸氣 滅菌 滅菌是指用物理或化學的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物以及 芽孢 ，使之達到無菌保障水平。 滅菌條件為在 121?C， MPa 下滅菌 30 分鐘，待滅菌鍋壓力指示為 0 MPa 時，將滅菌后的培養(yǎng)液取出 置于避光處 存放 。 銅綠微囊藻的 接種 銅綠微囊藻 FACHB 905 購于中國科學院武漢水生所（武漢，中國）。 銅綠微囊藻的 培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為 SPXGB150 人工智能氣候箱。?C，光照在 20xx～ 4000 Lx 連續(xù)靜止培養(yǎng)。四環(huán)素類藥物對微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質合成和葉綠體的生成最終造成對微藻生長的抑制。 就 技術 而言， 實驗室對 本項目開展了前期研究，結果表明本項目在科學上和技術上是可行的。這些條件為實驗的順利進行奠定了基礎。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)，一個計數(shù)區(qū)分成 25 個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成 16 個小方格 共計 由 400 個小方格組成。 已知： 1 cm3體積 =10 mm10 mm10 mm= 1000 mm3 所以： mm3體積應含有 中 方格數(shù)為 25，即系數(shù) K=105 。進行兩次實驗，第一次試驗，將原液分別稀釋 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍和 50 倍，測定各稀釋倍數(shù)下相應的吸光度，并隨機選取 25 個中格中的 5 個進行細胞計數(shù)，并換算計算藻密度，第二次實驗，分別將原藻樣稀釋 20 倍、 30 倍、 40 倍、 50 倍、 60 倍和 100 倍，測定各稀釋倍數(shù)下相應的吸光度，并隨機選取 25 個中格中的 9 個進行細胞計數(shù)，并換算計算藻密度。分別測定 2 47 9 1 144 小時各藻樣的吸光度，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的生長曲線，并求 EC(50,96h)。 考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量 實驗原理 考馬斯亮藍 G250 是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍色染料，在 465 nm 處有最大吸收值。利用溶液顏