【正文】 上起到抗菌、殺菌和抑菌作用，其作用機(jī)理主要包括：通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌因喪失細(xì)胞壁保護(hù)而死亡；影響胞漿膜通透性，使細(xì)菌屏障和運(yùn)輸物質(zhì)功能受到障礙；影響蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制；影響核 酸代謝，使細(xì)菌生長(zhǎng)分裂受到抑制等等。 Acute toxicity。 本文同時(shí)通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)了四環(huán)素在銅綠微囊藻 液中的降解情況，結(jié)果表明： 該反應(yīng)屬于一級(jí) 動(dòng)力學(xué) 反應(yīng)， Ln（四環(huán)素濃度）與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系。 指導(dǎo)老師： 葉璟 審核意見： 教研室主任： 曹萍 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 摘要 ： 四環(huán)素 類抗生素 是 目前 使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一 , 其在環(huán)境中的大量殘留帶來(lái)了潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。 Smyth, M. R.。 Dahlem, A. M.。 Suzuki, M.。 Corcia, A. D.。 Tse, K.。 Furusawa, M.。 Klumpp, S., Tautomycin from the bacterium Streptomucesverticillatus another potent and specific inhibitor of protein phosphatase1 and phosphatese2A. FEBS Lett. 1990, 277 (12), 137140. 6. Matsushima, R.。 Kleppe, G.。 Bartram, J., Toxic Cyanobacteria in Water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. E amp。 掌握數(shù)據(jù)分析基本方法。 化合物染毒基本條件具備。置于 RXZ 智能人工氣候箱，溫度28177。 掌握急性毒性實(shí)驗(yàn)方法。 了解藻類的一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法。藻細(xì)胞用 BG11（ pH=）培養(yǎng)基培養(yǎng)。 急性毒性實(shí)驗(yàn)參照 OECD 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 三、設(shè)計(jì)的技術(shù)要求（論文的研究要求） 掌握藍(lán)藻培養(yǎng)方法； 掌握藻類急性毒性實(shí)驗(yàn)方法； 掌握蛋白含量測(cè)定方法； 掌握液相檢測(cè)抗生素的方法。 五、查閱文獻(xiàn)要求及主要的參考文獻(xiàn) 1. Chorus, I.。 Carmichael, W. W.。 addendum to Vol. 2, Health criteria and other supporting information. Geneva, Switzerland, 1998. 5. Mackintosh, C.。 Harada, K.。 Codispoti, B. A.。 Curini, R.。 Matsuura, K.。 Oishi, S.。 Kincaid, B.。 15～ 16 周： 整理數(shù)據(jù)，論文撰寫。結(jié)果表明： 1 mg/L 的四環(huán)素能夠刺激銅綠微囊藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，而 銅綠微囊藻在長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度 四環(huán)素 時(shí) 其 生長(zhǎng)明顯受到抑制 。 Microcystis aeruginosa。除從微生物培養(yǎng)液提取外，有些抗生素已能通過(guò)人工合成或半合成得到。 抗生素在畜禽生產(chǎn)中的使用就更加令人擔(dān)憂，常以高劑量使用治療各種疾病，以低劑量使用促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)和增產(chǎn)，因此其在畜禽生產(chǎn)中的使用量非常大。 北京大學(xué)臨床藥理研究所肖永紅教授等專家調(diào)查推算，中國(guó)每年生產(chǎn)抗生素原料 21萬(wàn)噸，有 萬(wàn)噸抗生素用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，占年總產(chǎn)量的 %。 多方面的資料表明，現(xiàn)有水處理技術(shù)對(duì)污水中含有的相當(dāng)一部分抗生素沒有明顯的去除效果如抗癲癇藥卡馬西平的去除率僅為 8%，而降血脂藥氯貝酸的去除率幾乎為 0，全部隨污水處理廠出水進(jìn)入受納水體。然而，研究表明，抗生素藥物只有 15%可被吸收利用，大約 85%未被代謝而被直接排放至環(huán)境中?？股卦谒a(chǎn)養(yǎng)殖中也被廣泛使用，近年來(lái)公布的數(shù)據(jù)表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用的抗生素僅有 20~30%被魚類吸收， 70~80%進(jìn)入水環(huán)境中。 1957 年，去甲環(huán)素被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)這些抗生素進(jìn)行降解研究，人們發(fā)現(xiàn)它們具有極為相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有 4個(gè)環(huán)線形相連構(gòu)成主體骨架，從此“四環(huán)素”被看成一類新的抗生素。在密集型畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)這種現(xiàn)象同樣嚴(yán)重。d1土霉素的量對(duì) 50 頭農(nóng)場(chǎng)喂養(yǎng)的西門塔爾牛進(jìn)行 5 d 口服實(shí)驗(yàn)，此后對(duì)其糞肥中土霉素含量進(jìn)行測(cè)定。k1 和 mg即由于抗生素環(huán)境濃度預(yù)測(cè)模型的不成熟，以及抗生素環(huán)境分布的變異性，局部地區(qū)的濃度真實(shí)值可能遠(yuǎn)大于預(yù)測(cè)平均值 ［ 9］ 。因此，對(duì)四環(huán)素類藥物的生態(tài)毒理研究非常必要。kg1［ 14］ 。通過(guò) 96 h 暴露，在四環(huán)素濃度大于 mgL1）和 mg強(qiáng)力霉素對(duì)綠藻的毒性為 IC50= mg試驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)所測(cè)定的抗菌藥對(duì)銅綠微囊藻藻都有不同程度的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（ EC50）值處于 mg/L 水平，同時(shí)，抗菌藥對(duì)藻類的急性毒性呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，并且銅綠微囊藻 對(duì)抗菌藥較為敏感 ［ 21］ 。 Migliore 等 ［ 22］ 的研究證實(shí)了該機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)植物的根是抗生素藥物的主要積累場(chǎng)所。L1時(shí)，土霉素對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。同時(shí)，根據(jù)水蚤繁殖測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程（ OECD， 1996）利用半靜態(tài)檢驗(yàn)估計(jì)其對(duì)水蚤生殖能力的毒性效應(yīng)。 Ferreira 等以硝化纖維過(guò)濾的大西洋海水中的鹵蟲為研究對(duì)象，通過(guò) 24 h 和 48 h 的鹵蟲死亡數(shù)計(jì)算死亡率，利用概率值分析法計(jì)算半致死濃度，結(jié)果顯示，四環(huán)素 24 h 和 48h IC50分別為 mgL1），其 NOEC 和 LOEC 值分別為 637 mg在水中溶解，在 乙醇 中略溶，在 氯仿 或 乙醚 中不溶。微溶于水，溶于 乙醇 和 丙酮 ，在空氣中穩(wěn)定，但易吸收水分，受強(qiáng)日光照射變色。 圖 11 四環(huán)素結(jié)構(gòu)式 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，各種 立克次氏體 、螺旋體、大型病毒等有抑制作用?？捎山鹈顾孛撀戎频?，或由培養(yǎng)能產(chǎn)生四環(huán)素 的放線菌的 發(fā)酵液 中提取。其他如放線菌屬、炭疽桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、梭狀芽孢桿 菌、奴卡菌屬等對(duì)四環(huán)素敏感。四環(huán)素的作用機(jī)制在于藥物能特異性地與細(xì)菌核糖體 30S 亞基的 A 位置結(jié)合，阻止氨基酰－ tRNA 在該位上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽連的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。色球藻綱藻體為單細(xì)胞體或群體；藻殖段綱藻體為絲狀體，有藻殖段。細(xì)胞常聚集成肉眼可見的群落，這些群落本為圓形，經(jīng)過(guò)時(shí)間發(fā)展可能會(huì)產(chǎn)生孔洞并呈不規(guī)則形狀。溫度低于 15?C 時(shí)其生長(zhǎng)會(huì)被顯著的抑制。藍(lán)藻的毒素是細(xì)胞內(nèi)毒素，當(dāng)細(xì)胞腐敗裂解后，毒素被釋放到水體中。 微囊藻毒素的污染現(xiàn)狀 微囊藻毒素的污染現(xiàn)狀 藍(lán)藻分布廣泛，全球各大洲范圍內(nèi)有多達(dá)六十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道過(guò)藍(lán)藻水華的發(fā)生，存在于藍(lán)藻細(xì)胞中的微囊藻毒素，隨著細(xì)胞的衰老、死亡或溶解會(huì)釋放到水體中，因此全世界很多地區(qū)、國(guó)家的天然水體， 甚至飲用水中都檢測(cè)到了微囊藻毒素。這其中，以云南滇池、江蘇太湖、安徽巢湖 的藍(lán)藻水華污染最為嚴(yán)重。徐海濱等對(duì)江西鄱陽(yáng)湖的調(diào)查顯示，水體微囊藻毒素最大為 pg/mL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)有素積累。陳剛等在原發(fā)性肝癌高發(fā)地區(qū)江蘇海 門等地的許多溝塘中檢出大量的微囊藻毒素，河水和溝塘水中檢出的 MC最高分別達(dá) 1558 pg/mL 和 300 pg/mL。劉天富等測(cè)得三門峽市飲用水調(diào)蓄池中微囊藻毒素在 ～ ng/L 之間，出水廠為 ～ ng/L。因此 研究四環(huán)素類抗生素對(duì)銅綠微囊藻的毒性、以及銅綠微囊藻對(duì)四環(huán)素的降解作用， 不僅有助于我們進(jìn)一步了解四環(huán)素類抗生素和銅綠微囊藻的特性，也旨 進(jìn)一步了解并掌握 四環(huán)素的化學(xué)性質(zhì)及生物有效性，化合物的染毒及抗生素殘留分析的方法。 藻類是最簡(jiǎn)單的光合營(yíng)養(yǎng)有機(jī)體，種類繁多，分布很廣，是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者。 本課題將研究 ： 銅綠微囊藻細(xì)胞 密度 與吸光度的關(guān)系 、 銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線及抑制率 、銅綠微囊藻 pH 變化規(guī)律 、 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 、 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 。7H2O、 CaCl24H2O、 ZnSO46H2O。3H2O g/L 3 硫酸鎂 MgSO42H2O g/L 8 無(wú)水碳酸鈉 Na2CO3 g/L 9 A5 1 ml/L 4ml 91 硼酸 H3BO3 g/L 92 氯化錳 MnCl25H2O g/L 96 硝酸鈷 Co(NO3)2隨后領(lǐng)取一潔凈 1 L 玻璃瓶，按上表 91～ 96 配置微量元素 A5 一瓶。 本實(shí)驗(yàn)采用 高壓蒸氣滅菌法 。將其余滅菌后的器皿放入 電熱鼓風(fēng)干燥箱中，在70?C 的環(huán)境下鼓風(fēng)干燥 2 小時(shí)。 接種時(shí)須滿足以下條件： 藻種的質(zhì)量一般要求選取無(wú)敵害生物污染、生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛的藻種培養(yǎng) ， 藻液的外觀應(yīng)顏色正常、無(wú)大量沉淀和無(wú)明顯附壁現(xiàn)象 ； 接種的藻液容量和新配培養(yǎng)液量的比例為 1:2～ 1:3； 接種的時(shí)間最好是在上午的 8 時(shí)～ 10 時(shí)，不宜在晚上接種。培養(yǎng)方法是 使用上述 250 mL 或 500 mL 的經(jīng)過(guò)藻液接種的三角燒瓶。每天搖動(dòng) 3 次 。多項(xiàng)研究表明，四環(huán)素類抗生素可能通過(guò)抑制葉綠體合酶的活性，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，影響植物發(fā)芽率和根的生長(zhǎng)，這與四環(huán)素對(duì)微藻的毒性研究結(jié)果相似。項(xiàng)目采用的實(shí)驗(yàn)方法和分析測(cè)試技術(shù)，都是公開報(bào)道經(jīng)過(guò)證實(shí)的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)，能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 14 3. 實(shí)驗(yàn) 方案與方法 四環(huán)素儲(chǔ)備液的配置 使用分析天平秤取 的四環(huán)素，加入經(jīng)滅菌烘干過(guò)的 10 mL 容量瓶中，并使用1000 μL的移液槍移取 10 mL 娃哈哈純凈水 配置成為濃度為 1000 mg/L的四環(huán)素 儲(chǔ)備液 10 mL。 計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為 1 mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為 l mm2，每個(gè)小方格的面積為 1/400 mm2。 因此：每 ml 菌懸液中含有細(xì)胞數(shù) = 每個(gè) 中 格中細(xì)胞平均數(shù)（ N） 系數(shù)（ K） 菌液稀釋倍數(shù)（ d） 。兩次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總，做出藻樣密度和吸光度之間的關(guān)系曲線，并線性擬合。 四環(huán)素對(duì)銅綠微囊藻的抑制率測(cè)定 生長(zhǎng)阻礙率： 00 100tKKK? ??? （ 32） 式中 ： K0—— 空白樣吸光度 ； Kt—— t 時(shí)刻吸光度 圖 31 測(cè)定銅綠微囊藻生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn) 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 16 銅綠微囊藻 pH變化規(guī)律 將 16 個(gè) 50 mL 三角燒瓶分別加入經(jīng)稀釋后的藻液， 初始藻密度為 106 個(gè) /mL?？捡R斯亮藍(lán) G250 能與蛋白質(zhì)通過(guò)范得華相互作用形成蛋白質(zhì) ——考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收 λmax的位置發(fā)生紅移，在 595 nm 處有最大吸收值。考馬斯亮藍(lán) G250 試劑呈色反應(yīng)顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測(cè)試蛋白質(zhì)量在 1 μg 左右。 位置濃度的蛋白質(zhì)溶液用酪蛋白配制，濃度控制在 10～ 30 mg/mL 實(shí)驗(yàn)方法 取 7 支試管，按下表加入試劑，將試管搖勻，放置 20 min。編號(hào)為 1 和 2 的 兩 瓶藻樣作為控制樣參照。 高效液相色譜檢測(cè)四環(huán)素在銅綠微囊藻液中的降解 實(shí)驗(yàn)原理 高效液相層析儀根據(jù)各種各樣的化工互作用力來(lái)分離混合物。 （ 2） 高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在 15～ 30 分鐘 ， 有些樣品甚至在 5 分鐘內(nèi)即可完成 ， 一般小于 1 小時(shí)。 （ 5） 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 18 大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。使用高效液相色譜儀分別測(cè)定 0、 2 4 7 9 1 144 小時(shí)各藻樣四環(huán)素的峰面積，繪制藻樣中四環(huán)素在控制組和各濃度梯度下的降解曲線。 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 19 測(cè)定銅綠微囊藻藻液中四環(huán)素含量時(shí)，使用一次性無(wú)菌 針頭抽取約 1 mL 藻液，經(jīng)濾頭過(guò)濾后置于離心管內(nèi)， 進(jìn)樣量為 20 μL。見下圖：橫坐標(biāo)為 680 nm波長(zhǎng)下， 銅綠微囊藻 的吸光度，縱坐標(biāo)為 藻 細(xì)胞 生物量 （單位 105個(gè) /mL）。 = 0204060801001200 藻細(xì)胞生物量(105 ) 吸光度 四環(huán)素對(duì)藍(lán)藻的急性毒性研究 21 表 41 銅綠微囊藻藻液吸光度數(shù)據(jù) 銅綠微囊藻液吸光度數(shù)據(jù) NO. c(四 ) 12/25 12/26 12/27 12/28 12/29 12/30 12/31 Abs Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av Abs Av 0 0 mg/L 1 2 3 4 1 mg/L