【正文】 mg/mL 牛血清蛋白。 考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量 實驗原理 考馬斯亮藍 G250 是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍色染料，在 465 nm 處有最大吸收值。進行兩次實驗，第一次試驗，將原液分別稀釋 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍和 50 倍，測定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機選取 25 個中格中的 5 個進行細胞計數(shù)，并換算計算藻密度，第二次實驗，分別將原藻樣稀釋 20 倍、 30 倍、 40 倍、 50 倍、 60 倍和 100 倍，測定各稀釋倍數(shù)下相應(yīng)的吸光度，并隨機選取 25 個中格中的 9 個進行細胞計數(shù)，并換算計算藻密度。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)，一個計數(shù)區(qū)分成 25 個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成 16 個小方格 共計 由 400 個小方格組成。 就 技術(shù) 而言， 實驗室對 本項目開展了前期研究，結(jié)果表明本項目在科學(xué)上和技術(shù)上是可行的。?C，光照在 20xx～ 4000 Lx 連續(xù)靜止培養(yǎng)。 銅綠微囊藻的 接種 銅綠微囊藻 FACHB 905 購于中國科學(xué)院武漢水生所（武漢，中國）。 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 12 高壓蒸氣 滅菌 滅菌是指用物理或化學(xué)的方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病微生物以及 芽孢 ，使之達到無菌保障水平。2H2O g/L 95 硫酸銅 CuSO4 表 21 配置 BG11培養(yǎng)液 編號 成分 化學(xué)式 單位含量 含量 1 硝酸鈉 NaNO3 g/L 2 磷酸氫二鉀 K2HPO42H2O、 Na2CO H3BO MnCl2所以，通過測定藻類的數(shù)量就可以評價有毒有害污染物對藻類生長的影響及對整個水生生態(tài)系統(tǒng)的綜合環(huán)境效應(yīng)。 而 關(guān)于四環(huán)素的急性毒性效應(yīng)的研究還非常有限，四環(huán)素 對生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者 —— 藻類 的 毒性的研究 尚不夠多 。廣東省典型供水水庫和淡水湖泊微囊藻毒素分布廣泛，毒素組成以 MCRR 為主，水庫微囊藻毒素含量在 0～ μg/L。 天然及水庫水體的微囊藻毒素污染 我國是一個湖泊眾多的國家， 20 世紀 90 年代以來，藍藻水華暴發(fā)的面積、強度以及藻毒素含量均在大幅度增長，由此帶來的環(huán)境和生物安全問題日益引起關(guān)注。 藻類水華 在許多富營養(yǎng)化水體中，由于藍藻的增殖，常常會形成大量的水華，這不但影響水質(zhì)，且在某些時期具毒性。銅綠微囊藻細胞大小僅有 3 至 8 微米，且其外沒有鞘包覆。多年來由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見病原菌包括葡萄球菌等革蘭陽性菌及腸桿菌屬等革蘭陰性桿菌對四環(huán)素多數(shù)耐藥，并且，同類品種之間存在交叉耐藥。但有嘔吐、惡心、腹瀉等 副作用 。C （分解）。L1（ 95%置信區(qū)間為： ~1129 mg Wollenberger 等根據(jù)水蚤急性毒性試驗的標準協(xié)議（ ISO， 1989b）測定了包括四環(huán)素類抗生素在內(nèi)的 9 種抗生素對水蚤的急性毒性，并根據(jù) 48 h 急性毒性試驗 EC50值進行排序。四環(huán)素類藥物對植物根的毒性較大，高濃度時顯著抑制初生根的生長，這可能與四環(huán)素在植物根部的蓄積量有關(guān)，在根部蓄積量最多，因此表現(xiàn)出對根生長的抑制作用最為顯著。 此外，四環(huán)素類藥物能夠抑制銅綠微囊藻和綠藻的蛋白質(zhì)合成。 Ferreira 等依據(jù) OECD201 準則《藻類生長抑制測試》（ OECD， 1984）研究了四環(huán)素對扁藻的生長抑制情況。雖然，人們對藥物及個人防護品污染物（ PPCPs）等新型污 染物造成的生態(tài)環(huán)境問題給予了越來越多的關(guān)注，而作為 PPCPs 這一大類污染物中的四環(huán)素類藥物的環(huán)境污染方面的研究還相對較少 ［ 10～ 13］ ，尤其是其污染機理及生態(tài)毒性的研究還處于研究的起始階段。 在德國農(nóng)業(yè)土壤和草原土壤的 0~10cm 土壤表層中分別檢測到含有 4 mg 在密集型養(yǎng)魚場，最終有 70%~80%藥物流入環(huán)境之中 ［ 5］ 。如此大量的畜禽糞便排放，是構(gòu)成我國抗生素面源污染的主要原因之一。同時，農(nóng)業(yè)濫用抗生素正在導(dǎo)致超級病毒的傳播，非傳染性疾病和免疫性疾病大大增加了，人類的免疫系統(tǒng)正在衰退，而抗生素的濫用也是造成新型疾病增加的原因之一。目前大部分醫(yī)院對藥物的使用仍以抗生素的處方為主，這就造成了醫(yī)療系統(tǒng)強加給生病病人抗生素的濫用；另有一些家庭自醫(yī)的人群，隨意到藥店擅自購買抗生素服用。 關(guān)鍵詞： 四環(huán)素、銅綠微囊藻、急性毒性、抑制、降解 Acute toxicity of tetracycline on Microcystis aeruginosa Abstract: Tetracycline antibiotics are widely used in the world. This is one of the largest types of antibiotics, which can remain in the environment and bring potential environmental risks. In this study, the ecotoxicity of tetracyclines on cyanobacteria Microcystis aeruginosa was studied. Growth inhibition of this kind of algae exposure to tetracycline was measured. pH values, protein content, were also studied to determine the acute toxicity of tetracycline on M. aeruginosa. The results showed that at low concentration 1 mg/L tetracycline can stimulate the growth of M. aeruginosa, and in prolonged exposure to high concentrations of tetracycline, M. aeruginosa growth was suppressed. This paper also detected the degradation of tetracycline in M. aeruginosa culture medium by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the reaction is a firstorder kiics reaction, Ln (tetracycline concentration) and the reaction time showed linear relationship. And discussed the future research directions, aimed to provide valuable reference for the ecological risk assessment of the antibiotics. KeyWords: Tetracycline。 5～ 14 周：實驗室實驗。 Watanabe, M. F.。 Bruno, M.。 Watanabe, M. F.。 Beasley, V. R.。 抗生素液相檢測方法基本建立。 二、 原始條件及數(shù)據(jù)： 銅綠微囊藻（ Microcystis aeruginosa） FACHB 905 購于中國科學(xué)院武漢水生所（武漢，中國）。 化合物的染毒及抗生素殘留分析。 急性毒性實驗及蛋白含量檢測條件具備。 FN SPON Routledge: New York, 1999. 2. Galey, F. D.。 Yoshizawa, S.。 Boynton, A. L., Characterization of natural toxins with inhibitory activity against serine thereonine protein phosphatases. Toxicon 1994, 32 (3), 339350. 8. Bogtalli, S.。 Oka, H.。 Wasberg, M., Electrochemical detection of microcystins, cyanobacterial peptide hepatotoxins, following highperformance liquid. 六、進度安排：（設(shè)計或論文各階段的要求，時間安排） 1～ 4 周： 文獻綜述撰寫，英文翻譯。 為今后的研究方向進行了探計，旨在為其生態(tài)風險評價提供有價值的參考。 一般來說，抗生素包括人用和獸用兩類。超過 90%的人類使用的抗生素以活性形式排出體外，這些抗生素接著出現(xiàn)在我們的飲用水中，不僅會進入人體干擾正常的菌群平衡，而且還可以通過殺滅周圍環(huán)境中的有益菌來破壞生態(tài)平衡。到 20xx 年，全國 畜禽糞便的排放量將達 45 億噸。 四環(huán)素類抗生素在進入人或動物體內(nèi)后，由于氧化、還原、水解以及共軛接合作用，這些藥物形態(tài)的改變使其理化性質(zhì)和生態(tài)毒性發(fā)生變化，但研究顯示，隨動物體排出以后，代謝物質(zhì)可能會恢復(fù)為其母體化合物 ［ 4］ 。k1。尤其是隨著集約化現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素類藥物構(gòu)成對環(huán)境以及對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 3 的威脅日益暴露。 四環(huán)素類藥物對微藻的毒性主要體現(xiàn)在抑制微藻蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成最終造成對微藻生長的抑制。L1）。多項研究表明，四環(huán)素類抗生素可能通過抑制葉綠體合酶的活性，從而對植物生長產(chǎn)生抑制作用，影響植物發(fā)芽率和根的生長，這與四環(huán)素對微藻的毒性研究結(jié)果相似。 四環(huán)素類抗生素對動物的 生態(tài)毒性 四環(huán)素類抗生素能夠抑制水生動物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈 O去乙基酶、β 半乳糖苷酶等，并可能造成魚類較嚴重的 DNA 損傷。L1）和 mg黃色晶體，熔點 170～ 175176。供口服。四環(huán)素對弧菌、鼠疫桿菌、 布魯菌屬 、彎曲桿菌、耶爾森菌等革蘭陰性菌抗菌作用良好，對銅綠假單 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 6 胞菌無抗菌活性，對部分 厭氧菌屬 細菌具一定抗菌作用，但遠不如甲硝唑、克林霉素和氯霉素，因此臨床上并不選用。 銅綠微囊藻概述 銅綠微囊藻是常見的水華藍藻，屬原核生物界、真細菌、藍藻門、藍藻綱、色球藻目、微囊藻科、微囊藻屬。除了毒素外，銅綠微囊藻形成水華時淡水溶氧量的顯著降低也會導(dǎo)致水中動物的死亡。大型湖泊、河流中藍藻釋放的藻毒素可被大量水體稀釋，但大規(guī)模藍藻水華溶解時，就會使毒素達到較高濃度，造成潛在危害。 20xx 年對北京市重要飲用水水源地官廳水庫、密云水庫和懷柔水庫水源水樣進行藻毒素調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在藻類的高發(fā)季節(jié)， 3 個水庫水體中均檢出 MC，其中官廳水庫 7月份 MC 最高值達到 20 μg/L。 課題研究 的 意義 和目的 無論是抗生素還是銅綠微囊藻水華 引起的水體污染 都是當今水生態(tài)環(huán)境面臨的重要問題，而兩者 普遍存在于水體中，共存的可能性很大。在一定環(huán)境條件下，如果某種有毒有害的化學(xué)物質(zhì)及其復(fù)合污染物進入水體，藻類的生命活動就會受到影響，生物量就會發(fā)生改變。H2O、 C12H22FeN3O1C10H14N2O8Na2 預(yù)實驗 BG11 培養(yǎng)液的配置 本實驗所配培養(yǎng)液為 BG11 培養(yǎng)液，每次配制 1 瓶（ 4 L）。7H2O g/L 94 鉬酸鈉 Na2MoO4 再取 1000 μL的Dragonlab TopPette 移液槍 移取 A5 液 4 mL 加入上述 4 L 的玻璃瓶中。本實驗所有實驗器皿均須滅菌操作。 藻液的培養(yǎng)環(huán)境為： 溫度為 25177。我們的課題四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究在理論上是能夠得到支持的。 血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有 4 條槽而構(gòu)成 3 個平臺。 銅綠微囊藻相對增長速率 K的計算： 0( ln ln ) /tK N N t?? （ 31） 式中 K—— 相對增長率 Nt—— 處理 t時刻的細胞密度 (個 / mL) N0 —— 起始密度 (個 / mL)， t—— 培養(yǎng)時間 ρ—— 生長阻礙率 四環(huán)素對藍藻的急性毒性研究 15 實驗方法 使用血球計數(shù)板，計數(shù)一定濃度下，藻細胞個數(shù)。測定第 0、 4 9144 小時各藻樣的 pH，繪制藻樣在控制組和各四環(huán)素濃度下的 pH 變化規(guī)律曲線。該染色液可保存數(shù)月，若不加水可長期保存，用前稀釋。分別測定 7 144 小時吸光度?？蛇x擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。取 10 mL 潔凈試管 17 支，并逐一配置以下濃度四環(huán)素標準溶液： 100 mg/L、 50 mg/L、 25 mg/L、 10 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 mg/L、 50 μg/L、 25 μg/L、 10 μg/L、 μg/L、 μg/L。 實驗于每天下午 13:0014:00 測定各瓶 銅綠