【正文】 測就輕而一舉地篩選出重組菌落。棄上清，吸干水， CaCl2重懸菌體。 (7) 取適量菌液（體積別超過200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細胞，棄去一部分培養(yǎng)基后，重懸細菌后再涂），加入5ul IPTG（） 和30ul Xgal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應(yīng)涼下來用，否則容易燙死細菌。如果負對照長出菌落說明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對照沒出來，說明感受態(tài)細胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細菌死亡（如涂布時燙死）。在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導的遺傳轉(zhuǎn)化最多。Vir區(qū)的作用：該區(qū)基因不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它在TDNA轉(zhuǎn)移的過程中起著十分重要的作用，這個區(qū)的缺矢或突變會使發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株喪失對植物的侵染能力。β葡糖苷酸酶基因，簡稱Gus基因，是從大腸桿菌中分離克隆到的一個基因。而且，可通過卡方測驗，來檢測籽粒顏色分離是否符合孟德爾的分離規(guī)律。一次可以向數(shù)以千計的細胞導人基因，不受細胞、組織或器官的類型限制，此外其目標命中率高，因此格外受重視。2 可裂膜選用1550psi，將可裂膜、載體膜事先用70％乙醇浸泡半小時，在超凈工作臺晾干。4 第二天鏡檢,白色背景上的藍色斑點既是GUS表達位點。 實驗材料土豆、玉米等農(nóng)作物試劑及儀器10buffer: 500mM KCl 100mM TrisHCl () % 明膠 1% TritonX100MgCl2 ４dNTP: 1mM引物： 3種RAPD引物 模板： 20ng/μlTaq酶： 5u/μlPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)實驗方法 １．向無菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。2 放入30度恒溫箱過夜培養(yǎng)。微彈復合體對受體細孢造成的損傷可以修復。它是繼農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法之后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。這樣轉(zhuǎn)基因植株上收獲的種子，用XGluc試劑溶液處理，籽粒中出現(xiàn)顏色分離。Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動質(zhì)粒DNA的復制。它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點。隨著科學家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉(zhuǎn)入目的植物方法發(fā)展較快，現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導法、基因槍轟擊法、細胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學法及電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導法是今仍然廣泛使用的一種有效轉(zhuǎn)化方法。一般來說采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高，而平末端或單一酶切位點連接的重組率較低。 (6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右時，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。棄上清，吸干殘存培養(yǎng)基， CaCl2,重懸菌體，置冰浴1530min。此酶能使顯色底物Xgal分解成藍色化合物，從而使菌落發(fā)藍。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法，如插入失活法、抗性篩選、藍白篩選、雜交篩選、免疫學篩選、酶切圖譜鑒定、PCR鑒定等。 ,但載體環(huán)化受ATP濃度影響較大， 環(huán)化程度最大。影響連接效率的因素很多，如反應(yīng)溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質(zhì)、反應(yīng)時間、ATP濃度等。 7) 去掉Syringe，10 000g（~6cm 13000rpm）離心2min以干燥樹脂。 12) 1 500rpm離心2min,回收上清,取10ul電泳檢測。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝膠。 2) 將切下的膠放到離心管中，加入200ul的TE，65℃溫浴3min以融化低熔點膠。若已達到酶切目的可結(jié)束反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)，一般能識別46個堿基對，并在特定位點切割，例如HindIII的識別序列：。 過度洗膜。趕走氣泡，使反應(yīng)液均勻分布，封口后1525℃平放5 min。 經(jīng)過雜交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室溫下振動洗膜5min，重復一次。實驗步驟 1) 取純化好的待標DNA 1μg，體積為16μl，于100℃水浴中變性10min，取出后立即置于冰上5 min。 另一類是直接與核酸進行化學反應(yīng)而連接在核酸上, 如生物素化學標記法的主要思路是: 將生物素與另一種化學性質(zhì)較活潑的基團相連, 在特定的條件下是活潑基團活化而與核苷酸特定部位共價結(jié)合。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。2．溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。只要創(chuàng)造上述影響因素，即可使蛋白質(zhì)從植物葉片中分離并沉淀出來。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。RNA降解：B. 待提取RNA的樣品沒有保存于60至70℃,而保存在了5至20℃C. 細胞在用胰酶處理時過度D. 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理E. DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少B. 樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml ( NaCl)混合離心,按之前操作進行。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加510μg RNasefree糖原。移去上清。5. 每使用1ml ，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。c．細胞懸液 離心收集細胞，每510106動物、植物、酵母細胞或1107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。 2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、4 mol/L異硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。上清液中加入異丙醇或無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase處理去除少量的RNA，即得植物總DNA溶液。蛋白質(zhì)的去除是用苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。 4． 高壓滅菌鍋 5． 研缽、剪刀、一次性手套等 (二) 藥品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 異硫氰酸胍 4. 醋酸鈉(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 瓊脂糖 11. 異丙醇 (三) 試劑配方 1． % DEPC水 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有how(event) class=t_tagDNA污染。取澄清的勻漿液進行下一步操作。8. 28℃10000g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。注意事項1. 從少量樣品（110mg組織或102104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高B．樣品勻漿時加的試劑量太少C. 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘D. 吸取水相時混入了有機相E .RNA沉淀未完全溶解。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。故溶液蛋白質(zhì)顆粒(溶質(zhì))呈溶解狀態(tài)；(3)欲提取植物組織中的蛋白質(zhì)必須利用溶解度的差異進行分離純化(如鹽析、有機溶劑分級沉淀法、疏水層析、結(jié)晶、加熱、離心分離等法)，利用分子大小和形狀差異進行分離純化(分子篩層析法)；還可利用電荷性質(zhì)的差異分離純化(離子交換法)。（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。為了防止電泳時兩極緩沖液槽內(nèi)pH和離子強度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內(nèi) 的緩沖液，混勻后再用。制成干膜可長期保存。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（kb）60~520~110~7~6~4~3~Amount of Agarose and TBE buffer for Typical Gel Sizes and Electrophoresis ParametersAgarose concentrationGel sizeAgarose1 TBE bufferSample volume/wellElectrophoresisVoltmATime% for Genomic DNA.68cm25ml10μl152015h1114cm75ml20μl152015h1120cm150ml20μl152015h2025cm300ml20μl152015h% for fragments from 200 to 3500bp such as STSs.1114cm75ml20μl25301224cm150ml18μl25302025cm200ml20μl25302424cm300ml16μl25302% for RAPDs.1114cm75ml20μl35401224cm150ml18μl35402025cm200ml20μl35402424cm300ml16μl35403% for fragments below 400bp such as plasimds, probe inserts or SSRs (Proportion of Metaphor agarose:Seakem agarose=2:1 or : for fine separation and resolution).1114cm75ml20μl10023h1224cm150ml18μl10023h1224cm120ml12μl10023h2025cm200ml20μl10023h2424cm300ml16μl10023h試劑配方1. 10TBE, TBETable 10 TBE Gel Buffer ( M Tris, 20 mM EDTA)Stock1 Liter3 Liter5 LiterTris base (MW=)Boric Acid (MW=) M EDTA pH * pH to with glacial acetic acid. A precipitate may form when stored for long periods of time.2. 凝膠載樣緩沖液： %溴酚藍，40%（m/V）蔗糖水溶液, 4℃保存protocols:15. Melt agarose in microwave oven, keeping covered to avoid evaporation and mixing vigorously several times during heating. Make sure all the agarose is dissolved (it takes longer to dissolve than lower concentrations). The solution surface can be marked before heating and add dH2O up to the mark after heating, or weigh again after heating and make up for the evaporated weight with dH2O. Heat up one more time. 16. Apply some vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small bubbles created by much mixing.17. Cool to about 55℃ (if desired, the flask can be placed into cool water to speed cooling), pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert bs and leave it to solidify (2030min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We o