【正文】 vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small bubbles created by much mixing.17. Cool to about 55℃ (if desired, the flask can be placed into cool water to speed cooling), pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert bs and leave it to solidify (2030min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4℃.18. Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough TBE buffer (table ) in to cover the gel by at least cm. Remove bs only when ready to load samples.19. Run samples into gel according to the parameters in table until the bromophenol blue dye has migrated to just above the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer.20. Remove tray from rig and stain in 1μg/ml ethidium bromide (100μl of 10 mg/ml ethidium bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaking. CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenic—wear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution.21. Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For Fotodyne PCM10 camera with 2026 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or , 1sec exposure. For Fotodyne MP4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or , 2 min exposure.注意事項1．瓊脂糖凝膠電泳時加樣側應位于負極端。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。制成干膜可長期保存。（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。為了防止電泳時兩極緩沖液槽內pH和離子強度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內 的緩沖液，混勻后再用。含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。儀器和試劑儀器離心機、移液器、研缽、離心管、冰箱。故溶液蛋白質顆粒(溶質)呈溶解狀態(tài)；(3)欲提取植物組織中的蛋白質必須利用溶解度的差異進行分離純化(如鹽析、有機溶劑分級沉淀法、疏水層析、結晶、加熱、離心分離等法)，利用分子大小和形狀差異進行分離純化(分子篩層析法)；還可利用電荷性質的差異分離純化(離子交換法)。植物葉蛋白或稱綠色蛋白濃縮物(leafproteinconcentration，簡稱LPC)，是從新鮮植物葉片中提取的高質量濃縮蛋白質，不僅是畜禽生長發(fā)育和生產畜產品的主要營養(yǎng)物質，而且目前也正成為人類的保健營養(yǎng)理想食品之一。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。4. 在研磨過程中，利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態(tài)。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高B．樣品勻漿時加的試劑量太少C. 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘D. 吸取水相時混入了有機相E .RNA沉淀未完全溶解。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中28℃一星期以上或5至20℃一年以上。注意事項1. 從少量樣品（110mg組織或102104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。28℃不超過7500g離心5分鐘，棄上清。8. 28℃10000g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。取澄清的勻漿液進行下一步操作。2．將勻漿樣品在室溫（1530℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有how(event) class=t_tagDNA污染。方法21. 勻漿處理: 將組織在液氮中磨碎,每50100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。 4． 高壓滅菌鍋 5． 研缽、剪刀、一次性手套等 (二) 藥品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 異硫氰酸胍 4. 醋酸鈉(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 瓊脂糖 11. 異丙醇 (三) 試劑配方 1． % DEPC水 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。實驗二 RNA的制備和分析實驗目的通過本實驗學習和掌握從植物組織中提取RNA的方法實驗原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。蛋白質的去除是用苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質?！渡锛夹g大實驗》實驗指導（試行）四川農業(yè)大學農學院64目錄第一章 基因克隆技術………………………………………………………3實驗一 植物基因組DNA的提取及檢測 ………………………………………………3實驗二 RNA的制備和分析………………………………………………………………6實驗三 蛋白質的提取及檢測……………………………………………………………9實驗四 瓊脂糖電泳技術…………………………………………………………………11實驗五 PCR基因擴增及其影響因素分析………………………………………………17實驗六 核酸印跡技術DIG標記探針的分子雜交……………………………………20實驗七 λDNAHindⅢ酶切鑒定…………………………………………………………24實驗八 DNA片段的純化回收…………………………………………………………26實驗九 DNA體外重組…………………………………………………………………29實驗十 重組DNA的藍白篩選…………………………………………………………31第二章 植物基因轉化技術………………………………………………35實驗一 農桿菌浸染的油菜花瓣轉化表達GUS基因試驗……………………………35實驗二 基因槍介導的基因轉化實驗……………………………………………………38實驗三 轉化目的基因的檢測 GUS組織化學染色……………………………………39第三章 植物育種分子標記技術………………………………………40實驗一 RAPD分子標記技術……………………………………………………………36實驗二 SSR分子標記技術（包括垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳）………………………43實驗三 SNP分子標記技術………………………………………………………………47第四章 重組蛋白誘導表達………………………………………………49 實驗一 大腸桿菌菌種的活化和菌種的保存……………………………………………49實驗二 感受態(tài)細胞的制備采用CaC12 法制備感受態(tài)細胞…………………………50實驗三 堿式裂解法提取表達載體質?！?2實驗四 大腸桿菌的熱激轉化法…………………………………………………………54實驗五 Taq聚合酶基因的誘導表達……………………………………………………55實驗六 Taq聚合酶的提取純化…………………………………………………………57實驗七 SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Taq聚合酶分子量及純度………………58實驗八 Taq聚合酶活性單位標定和比活性檢測………………………………………60第五章 生物信息數據庫及生物軟件的使用…………………61實驗一 NCBI等數據庫的使用…………………………………………………………61實驗二 常用生物軟件的使用……………………………………………………………63第一章 基因克隆技術實驗一 植物基因組DNA的提取及檢測實驗目的通過本實驗學習和掌握從植物組織中提取DNA的方法實驗原理基因組DNA的提取包括組織粉碎，細胞膜破壞，其DNA含量豐富，組織易于破碎。上清液中加入異丙醇或無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase處理去除少量的RNA，即得植物總DNA溶液。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質，破壞細胞結構，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。 2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、4 mol/L異硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。c．細胞懸液 離心收集細胞，每510106動物、植物、酵母細胞或1107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于28℃10000g離心10分鐘，取上清。5. 每使用1ml ，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。移去上清。，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加510μg RNasefree糖原。3. 分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600g離心3060分鐘。RNA降解：B. 待提取RNA的樣品沒有保存于60至70℃,而保存在了5至20℃C. 細胞在用胰酶處理時過度D. 溶液或離心管未經RNase去除處理E. DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少B. 樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml ( NaCl)混合離心,按之前操作進行。 5. RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細胞內源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時應戴手套，并注意時刻換新手套。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。天然蛋白存在于為數甚多的植物體內，對其分離應依據人們的利用目的及提取蛋白含量和品質加以考慮。只要創(chuàng)造上述影響因素，即可使蛋白質從植物葉片中分離并沉淀出來。試劑：℃下預冷丙酮(%β巰基乙醇)℃預冷的80%丙酮(%β巰基乙醇)實驗四 瓊脂糖電泳技術實驗目的通過本實驗學習和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術實驗原理在凝膠電泳中，首先應用的是瓊脂電泳，它具有下列優(yōu)點：（1）瓊脂含液體量 大，可達9899%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小，對蛋白質的吸附極微。（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。瓊脂（糖）電泳常用緩沖液的pH在69之間。天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。（2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。由于糖—磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分于質量相同，但構型不同的DNA分子。2．溴乙錠可引起基因突變，操作時要注意個人防護。實驗原理PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由