【正文】 tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel top face with TBE and remove b.4 Heat λDNA (30 ng/μl) and bromophenol blue loading buffer (table 2) mixture at 65℃ for 10 min and place immediately on ice for 5 min. Load in well as molecular weight marker.5 Load samples.6 Run electrophoresis at 125 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.7 Remove tray from tank and take picture with ultraviolet light in gel image system.注意事項(xiàng) 1 酶切反應(yīng)體系依不同的酶、不同的酶切目的而異。限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別并水解雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。沒用帶正電荷的尼龍膜而用其他類型的膜；探針濃度低或標(biāo)記效率差。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。將標(biāo)記好的探針沸水浴變性5－10min，冰上5min，加到雜交袋中，混勻，趕出氣泡。 Detection Buffer： TrisHCl、 NaCl及50mmol/L 。材料Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.實(shí)驗(yàn)步驟22. On ice, in ml centrifuge tube, add:StockFor 20 μlFinal concentrationddH2OUp to 20 μl10 buffer μl1 25 mmol/L MgCl2 μl mmol/L mmol/L (each) dNTP μl150 μmol/L1 μmol/L (each) primers μl μmol/LTemplate DNA10 ng/μl pCUSBKHyg ? ng/μl Genomic DNA μl ? μl 5 ng50 ng5 U/μl Taq μl1 U23. Amplify from maize genomic DNA with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 5 min94℃ for 30 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 30 sec72℃ for 30 sec24. Amplify from plasmid with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 1 min94℃ for 10 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 10 sec72℃ for 30 secNOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps. 25. In 500 ml flask, add g agarose and 200 ml TBE. Melt agarose in microwave oven, mixing several times during heating. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation.26. Tape ends of gel tray, insert b, pour agarose in and allow to be solidified.27. Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel top face with TBE and remove b.28. Load Φ174 Hinc II in first well as molecular weight marker and amplified samples one by one.29. Run electrophoresis at 85 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.30. Remove tray from tank, stain in μg/ml EB for 10 min with gentle shaking.31. Destain in 10 mmol/L MgCl2 for 5 min with gentle shaking.32. Rinse in H2O for 10 min with gentle shaking.33. Take picture with ultraviolet light in gel image system. 實(shí)驗(yàn)六 核酸印跡技術(shù)DIG標(biāo)記探針的分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諏?shí)驗(yàn)的核酸印跡技術(shù)基本原理，熟悉基本操作實(shí)驗(yàn)原理放射性核素因其靈敏度高而被人們利用在雜交篩選中，但它標(biāo)記探針可利用時間短（放射性同位素有半衰期，），并且對人體有害，易污染環(huán)境，所以近年來逐步發(fā)展了非放射性雜交篩選。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。DNA經(jīng)溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)兩個堿基之間，與核酸形成絡(luò)合物，在紫外（300nm,360nm）激發(fā)下，產(chǎn)生桔黃色熒光（590 nm可見光）。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。（3）電泳速度快。其特點(diǎn)是： (1)水化作用即蛋白質(zhì)分子表面附有能有效防止蛋白質(zhì)分子沉淀析出的水化膜； (2)電荷排斥作用水化膜外還有電荷層(具陰、陽離子)能有效地防止蛋白質(zhì)分子的凝集。實(shí)驗(yàn)原理以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。常見問題分析：得率低：B. RNA沉淀未完全溶解A260/A280 ：，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，70℃保存。每使用1ml ，室溫放置10分鐘。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。材料玉米、水稻、小麥等農(nóng)作物根或葉儀器試劑(一) 儀器 1． 低溫離心機(jī) 2． 分光光度計(jì) 3． 瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1% Na OH溶液浸泡過夜，之后再用DEPC水浸泡沖洗。DNA提取緩沖液主要是由對DNA有穩(wěn)定作用的鹽如Tris,EDTA和破壞細(xì)胞的試劑SDS或者CTAB組成。實(shí)驗(yàn)材料玉米、馬鈴薯等農(nóng)作物葉片試劑配方1. CTAB 抽提緩沖液Table 1 CTAB Extraction Buffer (100ml)*1 M TrisHcl pH NaCl M CTAB BME ml ml g ml* Use freshly made. Warm buffer to 6065℃ before adding CTAB (cetyltriethylammonium bromide) and BME (βmercaptoethanol). Add BME just prior to use under a fume hood.2. 氯仿/異戊醇（24:1,v/v）: 將氯仿和異戊醇按體積24:1的比例混勻，置棕色瓶中，4℃保存。 3. 5ΧMOPS 電泳緩沖液(pH ) MOPS mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L (溶液均需用DEPC處理過的水配制)操作步驟方法11. 取幼葉約250 mg在液氮中研磨至細(xì)粉， ml離心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震蕩搖勻； 3. 室溫放置5 min后， ml的氯仿，劇烈搖動離心管5 min； 4. 在8℃條件下，12000 rpm離心15 min； 5. 溶液分為兩層，下層為酚－氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管， ml異丙醇在15~30℃條件下，沉淀10 min； 6. 然后在, 2~8℃條件下，12000 rpm離心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液體部分，加入1 ml 75%酒精洗2次； 8. 風(fēng)干后，加入25 181。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。6. 28℃10000g離心15分鐘。9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。植物葉蛋白提取一般遵循如下基本原則：盡可能提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；破壞蛋白與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。然而瓊脂中有較多硫酸根，電滲作用大。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。3．紫外光對人眼有害，觀察時加蓋玻璃罩，觀察時間不宜太長。參與復(fù)制的有多種因素。DIG（地高辛）、HRP（辣根過氧化物酶）及生物素等, 它們常通過顯色，發(fā)光來顯示雜交信號。 2) 在冰上加入4μl隨機(jī)引物標(biāo)記試劑,其中含有核苷酸混合物、隨機(jī)引物、Klenow enzyme和反應(yīng)緩沖液。然后用洗膜液II（SSC, %SDS）6068℃洗兩次，每次15min。倒掉反應(yīng)液，封口，37℃放置10 min增強(qiáng)光子釋放。曝光時間短。限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，1個酶單位（1Unit）指的是在指定緩沖液中，37℃下反應(yīng)60min,完全酶切1μg的純DNA所用的酶量。3 使用加熱使酶失活應(yīng)視限制性內(nèi)切酶的特性而異；也可使用EDTA使酶失活。 3) 分別用酚/氯仿，氯仿抽提一次。 5) 加入10ul glassmilk混勻 ,室溫靜置5min。 . 試劑盒法(Technical bulletin of Wizard PCR Preps DNA Purification system Promaga公司): 1) 電泳分離PCR產(chǎn)物。 8) 將Minicolumn放入一新的離心管中，加入50ul ddH2O或TE到Minicolumn中， 放置1min，10000g，離心20sec。 1. 反應(yīng)溫度是比較重要的影響因素。 。而藍(lán)白篩選常用在重組子和非重組子的初步篩選中，它是通過載體和宿主菌之間基因內(nèi)互補(bǔ)來實(shí)現(xiàn)。若有外源片段插入載體的多克隆位點(diǎn)，則使β半乳糖苷酶基因失活，不能產(chǎn)生α肽，形成白色菌落。 4℃,5000rpm離心5min回收細(xì)胞。趁熱倒平板，每板20mL左右，室溫下凝固1015min。 轉(zhuǎn)化是一定設(shè)不加質(zhì)粒只含感受態(tài)宿主菌的負(fù)對照和加入已知抗性的質(zhì)粒的正對照，以便分析結(jié)果。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所使用的質(zhì)粒載體分根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩大類。Ri質(zhì)粒的環(huán)狀基因可按功能可分為Vir、TDNA、Ori三個區(qū)，該三個功能區(qū)在對植物的浸染與表達(dá)中分工明確。農(nóng)桿菌將TDNA轉(zhuǎn)入寄主的過程：首先受傷的植物從傷口處產(chǎn)生特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，與Vir區(qū)A基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程，TDNA區(qū)的兩端先后單鏈短裂，短裂下來的單鏈TDNA被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中與植物的基因組隨機(jī)的整合，Ri質(zhì)粒中移走的TDNA區(qū)通過DNA復(fù)制得到修復(fù)，因此盡管發(fā)生了單鏈TDNA的轉(zhuǎn)移，發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞沒有因此喪失任何遺傳信息。這種顏色反應(yīng)和籽粒顏色分離可以通過實(shí)驗(yàn)直接被觀察到。這種方法操作簡單，效率高，適應(yīng)性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)步驟1 取金粉懸液（ p m的金粉用無水乙醇消毒，懸浮于Iml 無菌水中）25p 1， 加人5,ug 質(zhì)粒DNA,50 y1 2 .5mol/L,2Cal ol/L亞精胺，充分混勻，離心，無水乙醇沉淀，重新懸于60風(fēng)無水乙醇，備用。3 70%酒精脫色224小時（除去葉綠素），中途換酒精。反應(yīng)物