【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 leave it to solidify (2030min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4℃.18. Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough TBE buffer (table ) in to cover the gel by at least cm. Remove bs only when ready to load samples.19. Run samples into gel according to the parameters in table until the bromophenol blue dye has migrated to just above the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer.20. Remove tray from rig and stain in 1μg/ml ethidium bromide (100μl of 10 mg/ml ethidium bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaking. CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenic—wear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution.21. Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For Fotodyne PCM10 camera with 2026 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or , 1sec exposure. For Fotodyne MP4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or , 2 min exposure.注意事項(xiàng)1．瓊脂糖凝膠電泳時(shí)加樣側(cè)應(yīng)位于負(fù)極端。2．溴乙錠可引起基因突變，操作時(shí)要注意個(gè)人防護(hù)。3．紫外光對(duì)人眼有害，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)五 PCR基因擴(kuò)增及其影響因素分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)的原理。掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來(lái)的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。材料Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.實(shí)驗(yàn)步驟22. On ice, in ml centrifuge tube, add:StockFor 20 μlFinal concentrationddH2OUp to 20 μl10 buffer μl1 25 mmol/L MgCl2 μl mmol/L mmol/L (each) dNTP μl150 μmol/L1 μmol/L (each) primers μl μmol/LTemplate DNA10 ng/μl pCUSBKHyg ? ng/μl Genomic DNA μl ? μl 5 ng50 ng5 U/μl Taq μl1 U23. Amplify from maize genomic DNA with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 5 min94℃ for 30 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 30 sec72℃ for 30 sec24. Amplify from plasmid with following program:1 cycle of30 cycles of 1 cycle ofKeeping at94℃ for 1 min94℃ for 10 sec72℃ for 5 min4℃55℃ for 10 sec72℃ for 30 secNOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps. 25. In 500 ml flask, add g agarose and 200 ml TBE. Melt agarose in microwave oven, mixing several times during heating. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation.26. Tape ends of gel tray, insert b, pour agarose in and allow to be solidified.27. Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel top face with TBE and remove b.28. Load Φ174 Hinc II in first well as molecular weight marker and amplified samples one by one.29. Run electrophoresis at 85 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.30. Remove tray from tank, stain in μg/ml EB for 10 min with gentle shaking.31. Destain in 10 mmol/L MgCl2 for 5 min with gentle shaking.32. Rinse in H2O for 10 min with gentle shaking.33. Take picture with ultraviolet light in gel image system. 實(shí)驗(yàn)六 核酸印跡技術(shù)DIG標(biāo)記探針的分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諏?shí)驗(yàn)的核酸印跡技術(shù)基本原理，熟悉基本操作實(shí)驗(yàn)原理放射性核素因其靈敏度高而被人們利用在雜交篩選中，但它標(biāo)記探針可利用時(shí)間短（放射性同位素有半衰期，），并且對(duì)人體有害，易污染環(huán)境，所以近年來(lái)逐步發(fā)展了非放射性雜交篩選。按照標(biāo)記方法的不同,主要有兩類(lèi), 一種是預(yù)先已連在NTP 或dNTP上, 因此可象放射性核素標(biāo)記的核苷酸一樣用酶促聚合反應(yīng)方法參入到核酸探針上, 如生物素, 地高辛等, 由于生物素等標(biāo)記物是連接在堿基上, 而不是磷酸基團(tuán), 因此不能用多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。 另一類(lèi)是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上, 如生物素化學(xué)標(biāo)記法的主要思路是: 將生物素與另一種化學(xué)性質(zhì)較活潑的基團(tuán)相連, 在特定的條件下是活潑基團(tuán)活化而與核苷酸特定部位共價(jià)結(jié)合。DIG（地高辛）、HRP（辣根過(guò)氧化物酶）及生物素等, 它們常通過(guò)顯色，發(fā)光來(lái)顯示雜交信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)中就是通過(guò)連接臂共價(jià)連接在dUTP C11上，如圖13所示。DIG標(biāo)記的dUTP代替部分dTTP摻入待標(biāo)探針中，經(jīng)雜交后用與堿性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）連接的DIG抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，通過(guò)Ap使反應(yīng)底物CSPD脫磷，脫磷后的產(chǎn)物不穩(wěn)定，繼續(xù)分解同圖13 DIG標(biāo)記的dUTP化學(xué)分子結(jié)構(gòu)圖14 Ap分解底物釋放光子的反應(yīng)過(guò)程圖15 DIG標(biāo)記探針的Southern blotting過(guò)程示意圖材料，試劑和儀器 1 材料：模板 DNA轉(zhuǎn)移的膜，待標(biāo)DNA探針 2 試劑 1) DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 試劑盒提供的試劑 濃縮的固體雜交液成分（DIG Easy Hyb granules），隨機(jī)引物標(biāo)記試劑(DIGHigh Prime)，10封閉液(Blocking solution)，DIG抗體AP(AntiDigoxigenin AP Conjugate)，反應(yīng)底物CSPD(CSPD readytouse) 2）洗膜液： （1）2%SDS（2）%%SDS。 3）雜交及免疫反應(yīng)所需附加的試劑 Maleic acid Buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl用固體NaOH 。 Washing buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl,%(v/v)tween20,用固體NaOH 。 Detection Buffer： TrisHCl、 NaCl及50mmol/L 。 3儀器：恒溫水浴震蕩器（室溫100℃），雜交袋，水浴鍋，暗盒。實(shí)驗(yàn)步驟 1) 取純化好的待標(biāo)DNA 1μg，體積為16μl，于100℃水浴中變性10min，取出后立即置于冰上5 min。 2) 在冰上加入4μl隨機(jī)引物標(biāo)記試劑,其中含有核苷酸混合物、隨機(jī)引物、Klenow enzyme和反應(yīng)緩沖液?；靹蚝笾?7℃保溫至少1hr，可長(zhǎng)至20h以提高標(biāo)記量。 3) 加2ul EDTA或65℃加熱10min中止反應(yīng),置－20℃放置備用。 將處理好的NC膜用2SSC浸潤(rùn)5min后放到雜交袋中，加入預(yù)雜交液（用Maleic acid Buffer稀釋10封閉液為1封閉液）50－100mL， 65℃預(yù)雜交30min6hr。 將預(yù)雜交過(guò)的膜放入雜交袋中，加入5mL的雜交液（用滅菌ddH2O溶解濃縮的固體雜交液成分）。將標(biāo)記好的探針?lè)兴∽冃?－10min，冰上5min，加到雜交袋中，混勻，趕出氣泡。42℃搖動(dòng)雜交過(guò)夜。 經(jīng)過(guò)雜交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室溫下振動(dòng)洗膜5min，重復(fù)一次。然后用洗膜液II（SSC, %SDS）6068℃洗兩次，每次15min。 1) 用50mLWashing buffer短暫浸膜15min。 2) 將膜置1blocking solution 100mL中封閉30min。 3) 用1blocking solution按1：10000稀釋DIG抗體AP至75mU/mL，將膜浸在10－20mL抗體溶液中30min。 4) 用100mL Washing buffer洗膜兩次，每次15min。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。 6．雜交信號(hào)檢測(cè) 1）將雜交膜放入小塑料袋中，有DNA一面朝上，在上面加1mL反應(yīng)底物CSPD。趕走氣泡，使反應(yīng)液均勻分布，封口后1525℃平放5 min。倒掉反應(yīng)液，封口，37℃放置10 min增強(qiáng)光子釋放。 2）用保鮮膜包好，暗室中壓X光片。曝光448hr。 注：光子的釋放在最初的幾個(gè)小時(shí)達(dá)到高峰，并能維持2448 hr。 注意事項(xiàng)DNA雜交信號(hào)沒(méi)有或很弱可