【正文】 同時(shí)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析方法，計(jì)算不同物種的遺傳距離，得出物種間的親緣關(guān)系。實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因油菜花瓣藥品試劑1) XGluc，用NN二甲基酰胺配成20mM的貯存液，分裝成每管100181。2) 浸染后掛牌在上面寫上自己的名字。油菜基因組中不存在Gus基因，因此，油菜的組織與XGluc試劑溶液不可能產(chǎn)生藍(lán)顏色反應(yīng)。TDNA區(qū)的特點(diǎn)與功能：TDNA區(qū)的基因群具有致使發(fā)狀根產(chǎn)生（包括生長素合成）的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因以及某些抗性標(biāo)記基因和特殊的酶切位點(diǎn)。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致TDNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)使同學(xué)了解農(nóng)桿菌對植物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本原理及具體操作過程，從而對轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和外源基因轉(zhuǎn)入植物后產(chǎn)生的特殊性狀具有更加感性的認(rèn)識。 注意: 1 ）質(zhì)粒DNA要純 2 ）受體細(xì)菌的OD600nm= 3） 重組質(zhì)粒的體積小于轉(zhuǎn)化菌液體積的1/10。 (4) 42℃熱休克90sec，不要搖動(dòng)試管。挑一單菌落于30mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖至OD600=，取出置于冰上1015min。宿主菌為缺失產(chǎn)生α肽段的突變體，但能產(chǎn)生其余肽段。但如果載體和目的DNA片段量較少，這種檢測就不經(jīng)濟(jì)了，倒不如做載體和插入片段不同比例的連接體系能獲得好結(jié)果。一般采用如下組合：粘端連接反應(yīng)16℃12小時(shí)或22℃45小時(shí)，平端連接反應(yīng)48℃12小時(shí)。這時(shí)可以進(jìn)行重復(fù)純化回收。 5) 將樹脂DNA混合液移入Syringe Barrel中，插入活塞緩慢將混合液推入 Minicolumn. 6) 分開syringe Barrel和Minicolumn ,去掉活塞。 9) 再加入125ul漂洗液,如此反復(fù)兩次。 3 Glassmilk法: 1) %瓊脂糖凝膠電泳PCR或酶切產(chǎn)物。 材料、試劑和儀器 材料待回收DNA樣品 試劑 1) 1% 低熔點(diǎn)膠，瓊脂糖， 2) glassmilk kit: 裂解緩沖液，漂洗液，glassmilk 3) TE, ddH2O, 4) 酚/ 氯仿, 氯仿, 無水乙醇，70％乙醇， 5) DNA回收試劑盒: 樹脂， 80％異丙醇，Syringe Barrel, 3儀器： 離心機(jī) ， 水浴鍋， 電泳儀 實(shí)驗(yàn)步驟 1 低熔點(diǎn)膠法： 1) 電泳到適當(dāng)位置后在目的DNA條帶的前端挖一長方形槽，向槽中加入融化的低熔 點(diǎn)膠，待凝固后進(jìn)行電泳。限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，經(jīng)過HindⅢ酶切之后就產(chǎn)生8個(gè)大小為23Kb， ， ， ， ，564bp，125bp的片斷，通過瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下可見到8條電泳條帶。成功的酶切為后續(xù)工作提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料。 注意事項(xiàng)DNA雜交信號沒有或很弱可能有以下原因引起: 試劑過期。 4) 用100mL Washing buffer洗膜兩次，每次15min。 將預(yù)雜交過的膜放入雜交袋中，加入5mL的雜交液（用滅菌ddH2O溶解濃縮的固體雜交液成分）。 Washing buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl,%(v/v)tween20,用固體NaOH 。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和純化DNA片段一種方法和技術(shù)。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。離子強(qiáng)度過高時(shí)，會(huì)有大量電流通過凝膠，因而產(chǎn)生熱量，使凝膠的水份量蒸發(fā)，析出鹽的結(jié)晶，甚至可使凝膠斷裂，電流中斷。（2）瓊脂作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。天然蛋白質(zhì)一般在溶液中呈穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，故LPC亦稱葉蛋白膠。思考題 1. 實(shí)驗(yàn)中使用的各種藥品的作用？ 2. 真核生物的總RNA提純后，可以繼續(xù)做那些工作？ 3. DNA和RNA相比，為什么說提純植物細(xì)胞的mRNA是研究結(jié)構(gòu)基因更關(guān)鍵的一步實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)的提取及檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜ぶ参锶~蛋白的幾種提取原理和方法，了解其意義及其應(yīng)用價(jià)值。預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1106細(xì)胞提取RNA分別為：肝和脾610μg ,腎34μg , ,胎盤14μg ,上皮細(xì)胞815μg ,成纖維細(xì)胞57μg 。℅SDS,用槍頭吸打幾次,5560℃,勿使用SDS溶液。用異丙醇沉淀水相中的RNA。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積()加1ml，用移液器吸打幾次。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。組織破碎方法有很多種，可以研磨，搗碎機(jī)搗碎，超低溫冷凍使組織細(xì)胞間結(jié)冰，稍加研磨即可以粉碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。實(shí)驗(yàn)步驟1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves after darkness treatment of several days, although older leaves that are not senescent may be used.2. Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze). Samples may be stored at 80℃ until ready to continue the following steps.NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4.3. Remove mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar prefrozen, add liquid nitrogen, grind to a fine powder with a prefrozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4. Add 2 ml warm (65℃) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle inversion.5. Incubate in a 65℃ water bath for 3040 min, mixing gently by inversion every 10 min. NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 69 under a fume hood. 6. Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for 15 min.7. Spin in a tabletop centrifuge with 8000~10000 rpm at room temperature for 15 min. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.NOTE: Below 15℃ the CTAB and nucleic acid plex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge.8. Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.9. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix well and keep at 20℃ for at least 10 min to separate out the DNA.10. Use a pin to hook out the DNA. Rinse it with icecold 70% ethanol twice and absolute ethanol once.11. Dry pellet in vacuum desiccator with middle speed for 10 min.12. Dissolve the DNA in 50 μl HPLC H2O. (Add 3 μl of 10mg/ml RNase A (preboiled), mix by gentle inversion and incubate at 37℃ for 30 min.)13. Dilute 50500 times and read absorbance at 260 nm and 280 nm in spectrophotomemter and calculate concentration and quality. 14. Store at 4℃ for use or 20℃ for a long time.注意事項(xiàng) 1. 葉片磨得越細(xì)越好 2. 移液器的使用 3. 由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。l DEPC處理過的水溶解RNA，儲(chǔ)藏于80℃冰箱備用。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在60至70℃保存至少一個(gè)月。從含有大量多糖的植物中提取RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。根據(jù)該原則，植物葉蛋白制備過程中一般需要有四種試劑①離液劑：尿素和硫脲等；②表面活性劑：又稱去垢劑，早期常用NPTritonx100等非離子型去垢劑，離子型去垢劑有SDS、膽酸鈉、LiDS等，還有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以凍存)與Zwittergent等雙性離子去垢劑；③還原劑：DTT、DTE、TBP、Trisbase等；④蛋白酶抑制劑及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物(Proteaseinhibitorcocktails)等，如為了去除緩沖液中存在的痕量重金屬離子，～5mmol/LEDTA，同時(shí)使金屬蛋白酶失活。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的， 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)五 PCR基因擴(kuò)增及其影響因素分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)的原理。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。本實(shí)驗(yàn)中就是通過連接臂共價(jià)連接在dUTP C11上，如圖13所示?；靹蚝笾?7℃保溫至少1hr，可長至20h以提高標(biāo)記量。 1) 用50mLWashing buffer短暫浸膜15min。 2）用保鮮膜包好，暗室中壓X光片。 雜交背景高可能由于預(yù)雜交時(shí)間短、洗膜不徹底、探針濃高、抗體濃度高和選用錯(cuò)誤類型膜等原因引起。本實(shí)驗(yàn)使用HindⅢ實(shí)驗(yàn)八 DNA片段的純化回收實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釪NA片段的純化回收基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理載體及目的DNA 片斷經(jīng)酶切后，如果無多余的片斷（如載體單切）可以直接酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收直接連接用。 4) 取上清，加入2倍體積的無水乙醇，20℃沉淀DNA 2hr以上，12 000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于10ul無菌水中，取1ul電泳檢測。 6) 8 000rpm離心1min，棄上清。 2) 用干凈無菌的刀片切割目的DNA條帶， Ep管中，積累凝膠至大約300ul。 9) 去除Minicolumn，將純化的DNA貯存于4℃或20℃。因?yàn)檫B接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，但在此溫度下僅含46bp的退火粘末端之間的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒熱運(yùn)動(dòng)的破壞，因此連接溫度應(yīng)介于酶的最適溫度和粘末端退火溫度之間，一般為422℃，平末端連接溫度要更低些。材料，試劑和儀器 1 材料:質(zhì)粒載體，插入DNA片段 2 試劑: Promega 公司的T4DNA連接酶試劑盒 3儀器：恒溫水浴鍋 實(shí)驗(yàn)步驟 1 連接 1) 采用20ul的體系，在滅菌的200μlEppendorf管中順序加入： 載體DNA X ul （ ug） PCR產(chǎn)物 X ul （ ug） 10Buffer T4DNA Ligase （） 用ddH2O補(bǔ)足至終體積 10ul . 2）1416℃連接反應(yīng)過夜。許多載體（如pUC,pBS等）都是帶有包括乳糖操縱子的調(diào)控序列和編碼β半乳糖苷酶前146個(gè)氨基酸的基因序列。利用此方法僅通過目