【正文】 度和低pH值條件下A280值偏高B．樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少C. 勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘D. 吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相E .RNA沉淀未完全溶解。8. 28℃10000g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有how(event) class=t_tagDNA污染。蛋白質(zhì)的去除是用苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。 2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、4 mol/L異硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。5. 每使用1ml ，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加510μg RNasefree糖原。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。2．溴乙錠可引起基因突變，操作時(shí)要注意個(gè)人防護(hù)。 另一類是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上, 如生物素化學(xué)標(biāo)記法的主要思路是: 將生物素與另一種化學(xué)性質(zhì)較活潑的基團(tuán)相連, 在特定的條件下是活潑基團(tuán)活化而與核苷酸特定部位共價(jià)結(jié)合。 經(jīng)過雜交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室溫下振動(dòng)洗膜5min，重復(fù)一次。 過度洗膜。若已達(dá)到酶切目的可結(jié)束反應(yīng)。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝膠。 7) 去掉Syringe，10 000g（~6cm 13000rpm）離心2min以干燥樹脂。 ,但載體環(huán)化受ATP濃度影響較大， 環(huán)化程度最大。此酶能使顯色底物Xgal分解成藍(lán)色化合物，從而使菌落發(fā)藍(lán)。 (6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右時(shí)，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。隨著科學(xué)家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉(zhuǎn)入目的植物方法發(fā)展較快，現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、細(xì)胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學(xué)法及電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是今仍然廣泛使用的一種有效轉(zhuǎn)化方法。Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動(dòng)質(zhì)粒DNA的復(fù)制。它是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法之后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。2 放入30度恒溫箱過夜培養(yǎng)。4 第二天鏡檢,白色背景上的藍(lán)色斑點(diǎn)既是GUS表達(dá)位點(diǎn)。一次可以向數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞導(dǎo)人基因，不受細(xì)胞、組織或器官的類型限制，此外其目標(biāo)命中率高，因此格外受重視。β葡糖苷酸酶基因，簡稱Gus基因，是從大腸桿菌中分離克隆到的一個(gè)基因。在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。 (7) 取適量菌液（體積別超過200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細(xì)胞，棄去一部分培養(yǎng)基后，重懸細(xì)菌后再涂），加入5ul IPTG（） 和30ul Xgal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應(yīng)涼下來用，否則容易燙死細(xì)菌。利用此方法僅通過目測就輕而一舉地篩選出重組菌落。材料，試劑和儀器 1 材料:質(zhì)粒載體，插入DNA片段 2 試劑: Promega 公司的T4DNA連接酶試劑盒 3儀器：恒溫水浴鍋 實(shí)驗(yàn)步驟 1 連接 1) 采用20ul的體系，在滅菌的200μlEppendorf管中順序加入： 載體DNA X ul （ ug） PCR產(chǎn)物 X ul （ ug） 10Buffer T4DNA Ligase （） 用ddH2O補(bǔ)足至終體積 10ul . 2）1416℃連接反應(yīng)過夜。 9) 去除Minicolumn，將純化的DNA貯存于4℃或20℃。 6) 8 000rpm離心1min，棄上清。實(shí)驗(yàn)八 DNA片段的純化回收實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釪NA片段的純化回收基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理載體及目的DNA 片斷經(jīng)酶切后，如果無多余的片斷（如載體單切）可以直接酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收直接連接用。 雜交背景高可能由于預(yù)雜交時(shí)間短、洗膜不徹底、探針濃高、抗體濃度高和選用錯(cuò)誤類型膜等原因引起。 1) 用50mLWashing buffer短暫浸膜15min。本實(shí)驗(yàn)中就是通過連接臂共價(jià)連接在dUTP C11上，如圖13所示。實(shí)驗(yàn)五 PCR基因擴(kuò)增及其影響因素分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)的原理。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的， 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在60至70℃保存至少一個(gè)月。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。l DEPC處理過的水溶解RNA，儲(chǔ)藏于80℃冰箱備用。組織破碎方法有很多種，可以研磨，搗碎機(jī)搗碎，超低溫冷凍使組織細(xì)胞間結(jié)冰，稍加研磨即可以粉碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積()加1ml，用移液器吸打幾次。用異丙醇沉淀水相中的RNA。預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1106細(xì)胞提取RNA分別為：肝和脾610μg ,腎34μg , ,胎盤14μg ,上皮細(xì)胞815μg ,成纖維細(xì)胞57μg 。天然蛋白質(zhì)一般在溶液中呈穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，故LPC亦稱葉蛋白膠。離子強(qiáng)度過高時(shí)，會(huì)有大量電流通過凝膠，因而產(chǎn)生熱量，使凝膠的水份量蒸發(fā)，析出鹽的結(jié)晶，甚至可使凝膠斷裂，電流中斷。瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和純化DNA片段一種方法和技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。 Washing buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl,%(v/v)tween20,用固體NaOH 。 4) 用100mL Washing buffer洗膜兩次，每次15min。成功的酶切為后續(xù)工作提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料。 材料、試劑和儀器 材料待回收DNA樣品 試劑 1) 1% 低熔點(diǎn)膠，瓊脂糖， 2) glassmilk kit: 裂解緩沖液，漂洗液，glassmilk 3) TE, ddH2O, 4) 酚/ 氯仿, 氯仿, 無水乙醇，70％乙醇， 5) DNA回收試劑盒: 樹脂， 80％異丙醇，Syringe Barrel, 3儀器： 離心機(jī) ， 水浴鍋， 電泳儀 實(shí)驗(yàn)步驟 1 低熔點(diǎn)膠法： 1) 電泳到適當(dāng)位置后在目的DNA條帶的前端挖一長方形槽，向槽中加入融化的低熔 點(diǎn)膠，待凝固后進(jìn)行電泳。 9) 再加入125ul漂洗液,如此反復(fù)兩次。這時(shí)可以進(jìn)行重復(fù)純化回收。但如果載體和目的DNA片段量較少，這種檢測就不經(jīng)濟(jì)了，倒不如做載體和插入片段不同比例的連接體系能獲得好結(jié)果。挑一單菌落于30mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖至OD600=，取出置于冰上1015min。 注意: 1 ）質(zhì)粒DNA要純 2 ）受體細(xì)菌的OD600nm= 3） 重組質(zhì)粒的體積小于轉(zhuǎn)化菌液體積的1/10。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致TDNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。油菜基因組中不存在Gus基因，因此，油菜的組織與XGluc試劑溶液不可能產(chǎn)生藍(lán)顏色反應(yīng)。同時(shí)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析方法，計(jì)算不同物種的遺傳距離，得出物種間的親緣關(guān)系。實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因油菜花瓣藥品試劑1) XGluc，用NN二甲基酰胺配成20mM的貯存液，分裝成每管100181。2) 浸染后掛牌在上面寫上自己的名字。TDNA區(qū)的特點(diǎn)與功能：TDNA區(qū)的基因群具有致使發(fā)狀根產(chǎn)生（包括生長素合成）的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因以及某些抗性標(biāo)記基因和特殊的酶切位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)使同學(xué)了解農(nóng)桿菌對(duì)植物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本原理及具體操作過程，從而對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和外源基因轉(zhuǎn)入植物后產(chǎn)生的特殊性狀具有更加感性的認(rèn)識(shí)。 (4) 42℃熱休克90sec，不要搖動(dòng)試管。宿主菌為缺失產(chǎn)生α肽段的突變體，但能產(chǎn)生其余肽段。一般采用如下組合：粘端連接反應(yīng)16℃12小時(shí)或22℃45小時(shí)，平端連接反應(yīng)48℃12小時(shí)。 5) 將樹脂DNA混合液移入Syringe Barrel中，插入活塞緩慢將混合液推入 Minicolumn. 6) 分開syringe Barrel和Minicolumn ,去掉活塞。 3 Glassmilk法: 1) %瓊脂糖凝膠電泳PCR或酶切產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，經(jīng)過HindⅢ酶切之后就產(chǎn)生8個(gè)大小為23Kb， ， ， ， ，564bp，125bp的片斷，通過瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下可見到8條電泳條帶。 注意事項(xiàng)DNA雜交信號(hào)沒有或很弱可能有以下原因引起: 試劑過期。 將預(yù)雜交過的膜放入雜交袋中，加入5mL的雜交液（用滅菌ddH2O溶解濃縮的固體雜交液成分）。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。（2）瓊脂作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。思考題 1. 實(shí)驗(yàn)中使用的各種藥品的作用？ 2. 真核生物的總RNA提純后，可以繼續(xù)做那些工作？ 3. DNA和RNA相比，為什么說提純植物細(xì)胞的mRNA是研究結(jié)構(gòu)基因更關(guān)鍵的一步實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)的提取及檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜ぶ参锶~蛋白的幾種提取原理和方法，了解其意義及其應(yīng)用價(jià)值。℅SDS,用槍頭吸打幾次,5560℃,勿使用SDS溶液。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。實(shí)驗(yàn)步驟1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves after darkness treatment of several days, although older leaves that are not senescent may be used.2. Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze). Samples may be stored at 80℃ until ready to continue the following steps.NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4.3. Remove mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar prefrozen, add liquid nitrogen, grind to a fine powder with a prefrozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4. Add 2 ml warm (65℃) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle inversion.5. Incubate in a 65℃ water bath for 3040 min, mixing gently by inversion every 10 min. NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 69 under a fume hood. 6. Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for 15 min.7. Spin in a tabletop centrifuge with 8000~10000 rpm at room temperature for 15 min. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.NOTE: Below 15℃ the CTAB and nucleic acid plex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge.8. Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.9. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix well and keep at 20℃ for at le