【導(dǎo)讀】實驗七SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Taq聚合酶分子量及純度………………第五章生物信息數(shù)據(jù)庫及生物軟件的使用…………………基因組DNA的提取包括組織粉碎，細胞膜破壞，，其DNA含量豐富，組織易于破碎。組織破碎方法有很多種，可以研磨，搗碎機搗碎，超低溫冷凍使組織細胞間結(jié)冰，稍加研磨即可以粉碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。DNA提取緩沖液主要是由對DNA有穩(wěn)定作用的鹽如Tris,EDTA和破壞細胞的試劑SDS或者CTAB組成。蛋白質(zhì)的去除是用苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異丙醇或無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase處理去除少量的RNA，即得植物總DNA溶液。

　　

【正文】 結(jié)合作用，干擾細胞蛋白質(zhì)的合成，并阻止肽鍵的形成 這是一種殺菌劑，它通過同７０Ｓ核糖體的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀(misreading) 這是一種殺菌劑，它通過同核糖體的３０Ｓ亞基的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯譯 這是一種抑菌劑，它通過同核糖體３０Ｓ亞基之間的結(jié)合作用，阻止細菌蛋白質(zhì)的合成氨芐青霉素抗性基因（bia或ampr），編碼的一種周質(zhì)酶，即β－內(nèi)酰胺酶，可特異地切割氨芐青霉素的β－內(nèi)酰胺環(huán)，從而使之失去殺菌的效力 氯酶素抗性基因（cai或cmlr）編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶，它特異地使氯霉素乙?；Щ?卡那霉素的抗性基因（kan或kanr）編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移霉，可對卡那霉素進行修飾，從而阻止其同核糖體之間發(fā)生相互作用 鏈霉素抗性基因（str或strr）編碼的一種特異性霉，可對鏈霉素進行修飾，從而抑制其同核糖體３０Ｓ亞基的結(jié)合 四環(huán)素抗性基因（tet或tetr）編碼的一種特異性的蛋白質(zhì)，可對細菌的膜結(jié)構(gòu)進行修飾，從而阻止四環(huán)素通過細胞膜從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi) 3儀器: 恒溫搖床， 冰凍離心機，恒溫培養(yǎng)箱， CaCl2轉(zhuǎn)化法 (1) 劃線復(fù)壯宿主菌37℃過夜。挑一單菌落于30mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖至OD600=，取出置于冰上1015min。 (2) 。4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干殘存培養(yǎng)基， CaCl2,重懸菌體，置冰浴1530min。 4℃,5000rpm離心5min回收細胞。棄上清，吸干水， CaCl2重懸菌體。放置于4℃用于轉(zhuǎn)化，若不用則加30%甘油置70℃?zhèn)浯妗?(3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細胞中，輕旋以混和內(nèi)含物，置于冰上30min。 (4) 42℃熱休克90sec，不要搖動試管。置冰上12min。 (5) 加400ul 液體培養(yǎng)基，37℃150rpm搖培4560min。 (6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右時，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。趁熱倒平板，每板20mL左右，室溫下凝固1015min。 (7) 取適量菌液（體積別超過200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細胞，棄去一部分培養(yǎng)基后，重懸細菌后再涂），加入5ul IPTG（） 和30ul Xgal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應(yīng)涼下來用，否則容易燙死細菌。 (8) 培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)し夂煤螅?7℃倒置培養(yǎng)過夜。待出現(xiàn)藍色時取出放在4℃冰箱中，使其顏色更加明顯。 注意: 1 ）質(zhì)粒DNA要純 2 ）受體細菌的OD600nm= 3） 重組質(zhì)粒的體積小于轉(zhuǎn)化菌液體積的1/10。 結(jié)果與分析 若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落，說明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化。根據(jù)藍白的比例可以判斷重組率，根據(jù)菌落數(shù)目可以計算出轉(zhuǎn)化率。一般來說采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高，而平末端或單一酶切位點連接的重組率較低。 轉(zhuǎn)化是一定設(shè)不加質(zhì)粒只含感受態(tài)宿主菌的負對照和加入已知抗性的質(zhì)粒的正對照，以便分析結(jié)果。如果負對照長出菌落說明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對照沒出來，說明感受態(tài)細胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細菌死亡（如涂布時燙死）。圖6 藍白篩選思考題 1 轉(zhuǎn)化的原理是什么?轉(zhuǎn)化注意事項? 2 藍白篩選的意義和原理?第二章 植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)實驗一 農(nóng)桿菌浸染的油菜花瓣轉(zhuǎn)化表達GUS基因試驗實驗?zāi)康霓D(zhuǎn)基因植物在近代工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、特別是農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域的研究和應(yīng)用越來越為人類所重視。通過農(nóng)桿菌對植物植株、器官、組織及細胞的侵染進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是將外源基因?qū)肽康闹参锏闹匾椒ㄖ弧１緦嶒炇雇瑢W(xué)了解農(nóng)桿菌對植物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本原理及具體操作過程，從而對轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和外源基因轉(zhuǎn)入植物后產(chǎn)生的特殊性狀具有更加感性的認識。實驗原理將外源基因人為導(dǎo)入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對植物進行有目的改造，由此獲得轉(zhuǎn)基因植物，其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改變。如轉(zhuǎn)基因的抗蟲棉花，通過人們的改造，使棉花在生長過程中體內(nèi)能夠自主地產(chǎn)生抵抗害蟲的毒素，以達到自我保護、減少農(nóng)藥使用增產(chǎn)增收的目的。隨著科學(xué)家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉(zhuǎn)入目的植物方法發(fā)展較快，現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、細胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學(xué)法及電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是今仍然廣泛使用的一種有效轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所使用的質(zhì)粒載體分根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩大類。在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根瘤農(nóng)桿菌侵染植物是一個非常復(fù)雜的過程。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致TDNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細胞。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點：是細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。它是非必要的遺傳物質(zhì)，一般控制細菌的次要性狀，可自我復(fù)制并具有遺傳的穩(wěn)定性，在特殊環(huán)境中對細菌的生存起著重要的作用。它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點。Ri質(zhì)粒的環(huán)狀基因可按功能可分為Vir、TDNA、Ori三個區(qū)，該三個功能區(qū)在對植物的浸染與表達中分工明確。Vir區(qū)的作用：該區(qū)基因不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它在TDNA轉(zhuǎn)移的過程中起著十分重要的作用，這個區(qū)的缺矢或突變會使發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株喪失對植物的侵染能力。Vir區(qū)7個基因群（AG）的A一直處于活性表達狀態(tài)而其它的6個基因通常情況下處于抑制狀態(tài)。發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主時，被損傷的植物細胞會合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，此時其可以與Vir區(qū)A基因的表達產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程。TDNA區(qū)的特點與功能：TDNA區(qū)的基因群具有致使發(fā)狀根產(chǎn)生（包括生長素合成）的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因以及某些抗性標(biāo)記基因和特殊的酶切位點。其在侵染的過程中轉(zhuǎn)移到寄主的細胞中與其DNA相整合，從而隨寄主細胞中的DNA進行復(fù)制和表達。由于真核細胞中才具有TDNA區(qū)的基因群中某些基因（如生長素合成的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因等）的功能啟動子，因而這些基因只能在寄主真核細胞中轉(zhuǎn)錄表達，在農(nóng)桿菌中處于抑制狀態(tài)。Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動質(zhì)粒DNA的復(fù)制。農(nóng)桿菌將TDNA轉(zhuǎn)入寄主的過程：首先受傷的植物從傷口處產(chǎn)生特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，與Vir區(qū)A基因的表達產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程，TDNA區(qū)的兩端先后單鏈短裂，短裂下來的單鏈TDNA被轉(zhuǎn)移到植物細胞中與植物的基因組隨機的整合，Ri質(zhì)粒中移走的TDNA區(qū)通過DNA復(fù)制得到修復(fù)，因此盡管發(fā)生了單鏈TDNA的轉(zhuǎn)移，發(fā)根農(nóng)桿菌細胞沒有因此喪失任何遺傳信息。β葡糖苷酸酶基因，簡稱Gus基因，是從大腸桿菌中分離克隆到的一個基因。當(dāng)它的產(chǎn)物β葡聚苷酸酶與特定的生色底物XGluc試劑結(jié)合，能產(chǎn)生特定的藍顏色反應(yīng) (β葡聚糖苷酶（GUS）可將XGluc水解成藍色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到) ，因此，常作為植物轉(zhuǎn)基因研究中的報道基因。用XGluc試劑溶液處理該基因轉(zhuǎn)化后的植物組織，通過組織化學(xué)的染色反應(yīng)，來“報道”植物是否被轉(zhuǎn)化，基因是否被導(dǎo)入。油菜基因組中不存在Gus基因，因此，油菜的組織與XGluc試劑溶液不可能產(chǎn)生藍顏色反應(yīng)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，把Gus基因?qū)胫劣筒说幕ò?，用XGluc試劑溶液處理，花瓣呈藍色反應(yīng)，證明Gus基因已經(jīng)整合至這一植株的染色體中。(由于Gus基因的插入是隨機的，而且，不可能同時插入在一對同源染色體的同一位點上，因此，染色體上的外源Gus基因在減數(shù)分裂過程中，會隨同源染色體發(fā)生分離重組。這樣轉(zhuǎn)基因植株上收獲的種子，用XGluc試劑溶液處理，籽粒中出現(xiàn)顏色分離。這種顏色反應(yīng)和籽粒顏色分離可以通過實驗直接被觀察到。而且，可通過卡方測驗，來檢測籽粒顏色分離是否符合孟德爾的分離規(guī)律。)試劑及配方浸染液：A: 50mmol/L 磷酸鈉緩沖液（）A: 定容100ml B: A取39ml B取61ml 混合定容100ml（500ml的液體培養(yǎng)出來的農(nóng)桿菌可以和1L的緩沖液混合1:2）實驗步驟1) 取浸染液浸染油菜花序，把那些太小的和已經(jīng)開花的去掉，也要去掉腋芽，要浸泡的是含苞欲放的花蕾、花蕾下面的嫩葉及腋芽，浸泡5分鐘。此后間隔5天重復(fù)浸泡。2) 浸染后掛牌在上面寫上自己的名字。3) 瞬時表達檢測取浸漬后710天的材料：浸泡幾天后就開花了檢測花瓣或新長出的腋芽或柱頭或花蕾下面的嫩葉。實驗二 基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化實驗實驗?zāi)康恼莆栈驑尳閷?dǎo)轉(zhuǎn)化的原理和方法實驗原理基因槍法，又稱生物彈法或微粒槍法、微粒轟擊法，是依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。它是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法之后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。這種方法操作簡單，效率高，適應(yīng)性強。一次可以向數(shù)以千計的細胞導(dǎo)人基因，不受細胞、組織或器官的類型限制，此外其目標(biāo)命中率高，因此格外受重視?；驑尭鶕?jù)其加速裝置可分為火藥式、電動式和氣動式。 經(jīng)適當(dāng)處理后，使DNA液均勻地吸附在或包裹于微小的鎢粉或金粉顆粒表面，利用基因槍的火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動力，發(fā)射出微彈與DNA的復(fù)合體，擊中并高速穿透真空室中受體細胞的細胞壁及細胞膜，進入細胞內(nèi)，從而達到將吸附于微彈上的外源DNA導(dǎo)人細胞或原生質(zhì)體，獲得整合與表達的目的。微彈復(fù)合體對受體細孢造成的損傷可以修復(fù)。實驗步驟1 取金粉懸液（ p m的金粉用無水乙醇消毒，懸浮于Iml 無菌水中）25p 1， 加人5,ug 質(zhì)粒DNA,50 y1 2 .5mol/L,2Cal ol/L亞精胺，充分混勻，離心，無水乙醇沉淀，重新懸于60風(fēng)無水乙醇，備用。2 可裂膜選用1550psi，將可裂膜、載體膜事先用70％乙醇浸泡半小時，在超凈工作臺晾干。3 每次吸取10風(fēng)DNA－金粉復(fù)合體涂布于載體膜，充分晾干4 選取生長狀態(tài)旺盛、大小一致的愈傷組織進行轟擊，靶材料距離可裂膜6cm，每皿受體材料轟擊1次。實驗三 轉(zhuǎn)化目的基因的檢測 GUS組織化學(xué)染色實驗?zāi)康恼莆誈US組織化學(xué)染色方法實驗原理適宜的反應(yīng)條件下，β葡聚糖苷酶（GUS）可將XGluc水解成藍色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到。實驗材料轉(zhuǎn)基因油菜花瓣藥品試劑1) XGluc，用NN二甲基酰胺配成20mM的貯存液，分裝成每管100181。L，保存于20℃。2) 底物溶液（染色液）：1mM XGluc加入100mM磷酸鈉緩沖液（pH=）,緩沖液中含10mM EDTANa2，15mM K3[Fe(CN)6](鐵氰化鉀)，15mM K4[Fe(CN)6](亞鐵氰化鉀)，%（V/V）Triton X100染色液：50mmol/L 磷酸鈉緩沖液（）中含：[Fe(CN)6] +[Fe(CN)6] +10mol/L Na2EDTA+ %(v/v) Tritonx100+% xgluc(注：母液兩周內(nèi)使用有效，最好現(xiàn)用現(xiàn)配)實驗器材小藥瓶，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱（37℃），微量移液器實驗步驟1 將材料放在5ml的離心管里面，管中預(yù)先加入2ml的染色液，回到實驗室用抽氣機抽氣1020min。2 放入30度恒溫箱過夜培養(yǎng)。3 70%酒精脫色224小時（除去葉綠素），中途換酒精。4 第二天鏡檢,白色背景上的藍色斑點既是GUS表達位點。實驗結(jié)果花瓣上GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點。第三章 植物育種分子標(biāo)記技術(shù)實驗一 RAPD分子標(biāo)記技術(shù)實驗?zāi)康倪\用PCRRAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，對不同種植物的基因組DNA進行PCR擴增，獲得指紋圖譜。同時運用統(tǒng)計分析方法，計算不同物種的遺傳距離，得出物種間的親緣關(guān)系。實驗原理隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技術(shù)之上的一種分子標(biāo)記方法，它是以一系列不同隨機排列的寡聚核酸單鏈為引物，對于所研究的基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰氨凝膠或者瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)EB染色來檢測擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。對于任一特定的RAPD引物，它同基因組DNA序列有特定的結(jié)合位點，這些位點在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布符合PCR反應(yīng)的條件，即隨機引物在模板的兩條鏈上有互補的位置，且引物的3’端相距在一定的長度范圍之內(nèi)，就可以擴增出來DNA片段，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA的片段的插入或者缺失，或者堿基突變就能夠?qū)е逻@些特定結(jié)合位點分布發(fā)生變化，而使PCR產(chǎn)物增加或者減少，發(fā)生分子量的變化，通過對于PCR產(chǎn)物的檢測分析即可以測出基因組在這些區(qū)域的多態(tài)性。 實驗材料土豆、玉米等農(nóng)作物試劑及儀器10buffer: 500mM KCl 100mM TrisHCl () % 明膠 1% TritonX100MgCl2 ４dNTP: 1mM引物： 3種RAPD引物 模板： 20ng/μlTaq酶： 5u/μlPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)實驗方法 １．向無菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。反應(yīng)物