【正文】 美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 另一類是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上, 如生物素化學(xué)標(biāo)記法的主要思路是: 將生物素與另一種化學(xué)性質(zhì)較活潑的基團(tuán)相連, 在特定的條件下是活潑基團(tuán)活化而與核苷酸特定部位共價(jià)結(jié)合。 3）雜交及免疫反應(yīng)所需附加的試劑 Maleic acid Buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl用固體NaOH 。實(shí)驗(yàn)步驟 1) 取純化好的待標(biāo)DNA 1μg，體積為16μl，于100℃水浴中變性10min，取出后立即置于冰上5 min。 將處理好的NC膜用2SSC浸潤(rùn)5min后放到雜交袋中，加入預(yù)雜交液（用Maleic acid Buffer稀釋10封閉液為1封閉液）50－100mL， 65℃預(yù)雜交30min6hr。 經(jīng)過(guò)雜交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室溫下振動(dòng)洗膜5min，重復(fù)一次。 3) 用1blocking solution按1：10000稀釋DIG抗體AP至75mU/mL，將膜浸在10－20mL抗體溶液中30min。趕走氣泡，使反應(yīng)液均勻分布，封口后1525℃平放5 min。 注：光子的釋放在最初的幾個(gè)小時(shí)達(dá)到高峰，并能維持2448 hr。 過(guò)度洗膜。實(shí)驗(yàn)原理利用限制性內(nèi)切酶切割DNA是DNA重組過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一。旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)，一般能識(shí)別46個(gè)堿基對(duì)，并在特定位點(diǎn)切割，例如HindIII的識(shí)別序列：。λDNA是噬菌體的基因組DNA, 是線狀，雙鏈的DNA, , 它的上面有7個(gè)HindⅢ若已達(dá)到酶切目的可結(jié)束反應(yīng)?；厥盏姆椒扔袀鹘y(tǒng)的方法，這些方法基于降低凝膠的熔點(diǎn)以釋放DNA，然后通過(guò)酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收，也有公司生產(chǎn)的商品化的試劑盒可用，這些試劑盒多采用凝膠裂解液（如含有降低熔點(diǎn)的NaI）融化凝膠釋放DNA后，采用特殊的硅膠樹(shù)脂吸附DNA后，用洗液洗去雜質(zhì)，最后用洗脫液洗出DNA。 2) 將切下的膠放到離心管中，加入200ul的TE，65℃溫浴3min以融化低熔點(diǎn)膠。 3) 離心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于適量的TE或無(wú)菌水中，電泳檢測(cè)回收 效果。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝膠。 8) 8000rpm離心數(shù)秒鐘,棄上清。 12) 1 500rpm離心2min,回收上清,取10ul電泳檢測(cè)。 4) 拔出注射器活塞備用，將 Syringe Barrel和Minicolumn 連接。 7) 去掉Syringe，10 000g（~6cm 13000rpm）離心2min以干燥樹(shù)脂。如果切膠過(guò)程中不慎帶上雜帶, 那么回收后電泳結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)兩條以上的帶。影響連接效率的因素很多，如反應(yīng)溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質(zhì)、反應(yīng)時(shí)間、ATP濃度等。從分子動(dòng)力學(xué)角度講，后者更為復(fù)雜，且速度也要慢得多，因此平末端的連接效率要低一些為粘末端連接效率的1/101/100。 ,但載體環(huán)化受ATP濃度影響較大， 環(huán)化程度最大。這在載體和目的DNA片段充足的條件下檢測(cè)不失為一種直觀的方法。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法，如插入失活法、抗性篩選、藍(lán)白篩選、雜交篩選、免疫學(xué)篩選、酶切圖譜鑒定、PCR鑒定等。若有外源基因插入多克隆位點(diǎn)則破壞編碼讀框產(chǎn)生沒(méi)活性的α肽段。此酶能使顯色底物Xgal分解成藍(lán)色化合物，從而使菌落發(fā)藍(lán)。 2 試劑: 1）LB固體培養(yǎng)基 2）LB液體培養(yǎng)基 4）5）抗生素母液 6) 7) 100mg/mL Xgal表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性機(jī)理 抗菌素名稱 作用方式 抗性機(jī)能 氨芐青霉素（Amp）母液:50mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 氯酶素（Cml） 母液:34mg/ml(溶乙醇) 工作濃度:170ug/ml 卡那霉素（Kan） 母液:10mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 鏈霉素（Sm） 母液:10mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 四環(huán)素（Tet） 母液:5mg/ml(溶乙醇) 工作濃度:50ug/ml 這是一種青霉素的衍生物，它通過(guò)干擾細(xì)菌胞壁合成之末端反應(yīng)，而殺死生長(zhǎng)的細(xì)胞 這是一種抑菌劑，它通過(guò)同核糖體５０Ｓ亞基的結(jié)合作用，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并阻止肽鍵的形成 這是一種殺菌劑，它通過(guò)同７０Ｓ核糖體的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀(misreading) 這是一種殺菌劑，它通過(guò)同核糖體的３０Ｓ亞基的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)譯 這是一種抑菌劑，它通過(guò)同核糖體３０Ｓ亞基之間的結(jié)合作用，阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成氨芐青霉素抗性基因（bia或ampr），編碼的一種周質(zhì)酶，即β－內(nèi)酰胺酶，可特異地切割氨芐青霉素的β－內(nèi)酰胺環(huán)，從而使之失去殺菌的效力 氯酶素抗性基因（cai或cmlr）編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶，它特異地使氯霉素乙?；Щ?卡那霉素的抗性基因（kan或kanr）編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移霉，可對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，從而阻止其同核糖體之間發(fā)生相互作用 鏈霉素抗性基因（str或strr）編碼的一種特異性霉，可對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，從而抑制其同核糖體３０Ｓ亞基的結(jié)合 四環(huán)素抗性基因（tet或tetr）編碼的一種特異性的蛋白質(zhì)，可對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而阻止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi) 3儀器: 恒溫?fù)u床， 冰凍離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱， CaCl2轉(zhuǎn)化法 (1) 劃線復(fù)壯宿主菌37℃過(guò)夜。棄上清，吸干殘存培養(yǎng)基， CaCl2,重懸菌體，置冰浴1530min。 (3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕旋以混和內(nèi)含物，置于冰上30min。 (6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右時(shí)，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。待出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)取出放在4℃冰箱中，使其顏色更加明顯。一般來(lái)說(shuō)采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高，而平末端或單一酶切位點(diǎn)連接的重組率較低。通過(guò)農(nóng)桿菌對(duì)植物植株、器官、組織及細(xì)胞的侵染進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是將外源基因?qū)肽康闹参锏闹匾椒ㄖ?。隨著科學(xué)家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉(zhuǎn)入目的植物方法發(fā)展較快，現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、細(xì)胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學(xué)法及電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是今仍然廣泛使用的一種有效轉(zhuǎn)化方法。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點(diǎn)。發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主時(shí)，被損傷的植物細(xì)胞會(huì)合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，此時(shí)其可以與Vir區(qū)A基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過(guò)程。Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動(dòng)質(zhì)粒DNA的復(fù)制。用XGluc試劑溶液處理該基因轉(zhuǎn)化后的植物組織，通過(guò)組織化學(xué)的染色反應(yīng)，來(lái)“報(bào)道”植物是否被轉(zhuǎn)化，基因是否被導(dǎo)入。這樣轉(zhuǎn)基因植株上收獲的種子，用XGluc試劑溶液處理，籽粒中出現(xiàn)顏色分離。此后間隔5天重復(fù)浸泡。它是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法之后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。微彈復(fù)合體對(duì)受體細(xì)孢造成的損傷可以修復(fù)。實(shí)驗(yàn)三 轉(zhuǎn)化目的基因的檢測(cè) GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誈US組織化學(xué)染色方法實(shí)驗(yàn)原理適宜的反應(yīng)條件下，β葡聚糖苷酶（GUS）可將XGluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)，可用肉眼或顯微鏡觀察到。2 放入30度恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。第三章 植物育種分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 RAPD分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪\(yùn)用PCRRAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)不同種植物的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得指紋圖譜。 實(shí)驗(yàn)材料土豆、玉米等農(nóng)作物試劑及儀器10buffer: 500mM KCl 100mM TrisHCl () % 明膠 1% TritonX100MgCl2 ４dNTP: 1mM引物： 3種RAPD引物 模板： 20ng/μlTaq酶： 5u/μlPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法 １．向無(wú)菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。實(shí)驗(yàn)原理隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技術(shù)之上的一種分子標(biāo)記方法，它是以一系列不同隨機(jī)排列的寡聚核酸單鏈為引物，對(duì)于所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰氨凝膠或者瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)EB染色來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。4 第二天鏡檢,白色背景上的藍(lán)色斑點(diǎn)既是GUS表達(dá)位點(diǎn)。L，保存于20℃。2 可裂膜選用1550psi，將可裂膜、載體膜事先用70％乙醇浸泡半小時(shí)，在超凈工作臺(tái)晾干。一次可以向數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞導(dǎo)人基因，不受細(xì)胞、組織或器官的類型限制，此外其目標(biāo)命中率高，因此格外受重視。3) 瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)取浸漬后710天的材料：浸泡幾天后就開(kāi)花了檢測(cè)花瓣或新長(zhǎng)出的腋芽或柱頭或花蕾下面的嫩葉。而且，可通過(guò)卡方測(cè)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)籽粒顏色分離是否符合孟德?tīng)柕姆蛛x規(guī)律。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，把Gus基因?qū)胫劣筒说幕ò辏肵Gluc試劑溶液處理，花瓣呈藍(lán)色反應(yīng)，證明Gus基因已經(jīng)整合至這一植株的染色體中。β葡糖苷酸酶基因，簡(jiǎn)稱Gus基因，是從大腸桿菌中分離克隆到的一個(gè)基因。其在侵染的過(guò)程中轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞中與其DNA相整合，從而隨寄主細(xì)胞中的DNA進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。Vir區(qū)的作用：該區(qū)基因不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它在TDNA轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起著十分重要的作用，這個(gè)區(qū)的缺矢或突變會(huì)使發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株喪失對(duì)植物的侵染能力。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點(diǎn)：是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨(dú)立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。實(shí)驗(yàn)原理將外源基因人為導(dǎo)入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對(duì)植物進(jìn)行有目的改造，由此獲得轉(zhuǎn)基因植物，其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改變。如果負(fù)對(duì)照長(zhǎng)出菌落說(shuō)明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對(duì)照沒(méi)出來(lái)，說(shuō)明感受態(tài)細(xì)胞有問(wèn)題或加錯(cuò)抗生素或操作過(guò)程中造成細(xì)菌死亡（如涂布時(shí)燙死）。 結(jié)果與分析 若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落，說(shuō)明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化。 (7) 取適量菌液（體積別超過(guò)200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細(xì)胞，棄去一部分培養(yǎng)基后，重懸細(xì)菌后再涂），加入5ul IPTG（） 和30ul Xgal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過(guò)滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應(yīng)涼下來(lái)用，否則容易燙死細(xì)菌。置冰上12min。棄上清，吸干水， CaCl2重懸菌體。 (2) 。利用此方法僅通過(guò)目測(cè)就輕而一舉地篩選出重組菌落。兩者之間進(jìn)行基因內(nèi)互補(bǔ)就產(chǎn)生有活性的β半乳糖苷酶基因。許多載體（如pUC,pBS等）都是帶有包括乳糖操縱子的調(diào)控序列和編碼β半乳糖苷酶前146個(gè)氨基酸的基因序列。實(shí)驗(yàn)十 重組DNA的藍(lán)白篩選實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馑{(lán)白篩選的基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理基因克隆的最后一道工序就是從眾多的轉(zhuǎn)化菌中篩選出目的陽(yáng)性克隆并鑒定重組子的正確性。材料，試劑和儀器 1 材料:質(zhì)粒載體，插入DNA片段 2 試劑: Promega 公司的T4DNA連接酶試劑盒 3儀器：恒溫水浴鍋 實(shí)驗(yàn)步驟 1 連接 1) 采用20ul的體系，在滅菌的200μlEppendorf管中順序加入： 載體DNA X ul （ ug） PCR產(chǎn)物 X ul （ ug） 10Buffer T4DNA Ligase （） 用ddH2O補(bǔ)足至終體積 10ul . 2）1416℃連接反應(yīng)過(guò)夜。 2. 插入片段和載體之間的摩爾比經(jīng)驗(yàn)值一般為310， 即插入片段要多于載體數(shù)，這樣有利于提高重組率。因?yàn)檫B接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，但在此溫度下僅含46bp的退火粘末端之間的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒熱運(yùn)動(dòng)的破壞，因此連接溫度應(yīng)介于酶的最適溫度和粘末端退火溫度之間，一般為422℃，平末端連接溫度要更低些。 思考題 1 純化回收DNA的目的是什么? 2 若DNA純化回收后的電泳結(jié)果為兩條帶,那么可能有哪些原因？如何補(bǔ)救？ 實(shí)驗(yàn)九 DNA體外重組實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釪NA體外重組的基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理載體與外源DNA分子體外重組時(shí)，如何選擇優(yōu)化連接條件以達(dá)到最高的重組率。 9) 去除Minicolumn，將純化的DNA貯存于4℃或20℃。重新連接Syrringe Barrel和 Minicolumn, 加入2mL 80％異丙醇到Syringe中以洗柱子。 2) 用干凈無(wú)菌的刀片切割目的DNA條帶， Ep管中，積累凝膠至大約300ul。 10) 沉淀中加入適量無(wú)菌雙蒸水混勻。 6) 8 000rpm離心1min，棄上清。 2) 紫外燈下迅速切下目的條帶,放入EP管中。 4) 取上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，20℃沉淀DNA 2hr以上，12 000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于10ul無(wú)菌水中，取1ul電泳檢測(cè)。當(dāng)DNA進(jìn)入低熔點(diǎn)膠中心時(shí)停止電泳。實(shí)驗(yàn)八 DNA片段的