【正文】 美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的。細胞中DNA的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 另一類是直接與核酸進行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上, 如生物素化學(xué)標記法的主要思路是: 將生物素與另一種化學(xué)性質(zhì)較活潑的基團相連, 在特定的條件下是活潑基團活化而與核苷酸特定部位共價結(jié)合。 3）雜交及免疫反應(yīng)所需附加的試劑 Maleic acid Buffer: Maleic acid（順丁烯二酸） NaCl用固體NaOH 。實驗步驟 1) 取純化好的待標DNA 1μg，體積為16μl，于100℃水浴中變性10min，取出后立即置于冰上5 min。 將處理好的NC膜用2SSC浸潤5min后放到雜交袋中，加入預(yù)雜交液（用Maleic acid Buffer稀釋10封閉液為1封閉液）50－100mL， 65℃預(yù)雜交30min6hr。 經(jīng)過雜交的膜用洗膜液I（2SSC, %SDS）室溫下振動洗膜5min，重復(fù)一次。 3) 用1blocking solution按1：10000稀釋DIG抗體AP至75mU/mL，將膜浸在10－20mL抗體溶液中30min。趕走氣泡，使反應(yīng)液均勻分布，封口后1525℃平放5 min。 注：光子的釋放在最初的幾個小時達到高峰，并能維持2448 hr。 過度洗膜。實驗原理利用限制性內(nèi)切酶切割DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)，一般能識別46個堿基對，并在特定位點切割，例如HindIII的識別序列：。λDNA是噬菌體的基因組DNA, 是線狀，雙鏈的DNA, , 它的上面有7個HindⅢ若已達到酶切目的可結(jié)束反應(yīng)?；厥盏姆椒扔袀鹘y(tǒng)的方法，這些方法基于降低凝膠的熔點以釋放DNA，然后通過酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收，也有公司生產(chǎn)的商品化的試劑盒可用，這些試劑盒多采用凝膠裂解液（如含有降低熔點的NaI）融化凝膠釋放DNA后，采用特殊的硅膠樹脂吸附DNA后，用洗液洗去雜質(zhì)，最后用洗脫液洗出DNA。 2) 將切下的膠放到離心管中，加入200ul的TE，65℃溫浴3min以融化低熔點膠。 3) 離心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于適量的TE或無菌水中，電泳檢測回收 效果。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝膠。 8) 8000rpm離心數(shù)秒鐘,棄上清。 12) 1 500rpm離心2min,回收上清,取10ul電泳檢測。 4) 拔出注射器活塞備用，將 Syringe Barrel和Minicolumn 連接。 7) 去掉Syringe，10 000g（~6cm 13000rpm）離心2min以干燥樹脂。如果切膠過程中不慎帶上雜帶, 那么回收后電泳結(jié)果可能會出現(xiàn)兩條以上的帶。影響連接效率的因素很多，如反應(yīng)溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質(zhì)、反應(yīng)時間、ATP濃度等。從分子動力學(xué)角度講，后者更為復(fù)雜，且速度也要慢得多，因此平末端的連接效率要低一些為粘末端連接效率的1/101/100。 ,但載體環(huán)化受ATP濃度影響較大， 環(huán)化程度最大。這在載體和目的DNA片段充足的條件下檢測不失為一種直觀的方法。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法，如插入失活法、抗性篩選、藍白篩選、雜交篩選、免疫學(xué)篩選、酶切圖譜鑒定、PCR鑒定等。若有外源基因插入多克隆位點則破壞編碼讀框產(chǎn)生沒活性的α肽段。此酶能使顯色底物Xgal分解成藍色化合物，從而使菌落發(fā)藍。 2 試劑: 1）LB固體培養(yǎng)基 2）LB液體培養(yǎng)基 4）5）抗生素母液 6) 7) 100mg/mL Xgal表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性機理 抗菌素名稱 作用方式 抗性機能 氨芐青霉素（Amp）母液:50mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 氯酶素（Cml） 母液:34mg/ml(溶乙醇) 工作濃度:170ug/ml 卡那霉素（Kan） 母液:10mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 鏈霉素（Sm） 母液:10mg/ml(溶水)工作濃度:50ug/ml 四環(huán)素（Tet） 母液:5mg/ml(溶乙醇) 工作濃度:50ug/ml 這是一種青霉素的衍生物，它通過干擾細菌胞壁合成之末端反應(yīng)，而殺死生長的細胞 這是一種抑菌劑，它通過同核糖體５０Ｓ亞基的結(jié)合作用，干擾細胞蛋白質(zhì)的合成，并阻止肽鍵的形成 這是一種殺菌劑，它通過同７０Ｓ核糖體的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯讀(misreading) 這是一種殺菌劑，它通過同核糖體的３０Ｓ亞基的結(jié)合作用，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯譯 這是一種抑菌劑，它通過同核糖體３０Ｓ亞基之間的結(jié)合作用，阻止細菌蛋白質(zhì)的合成氨芐青霉素抗性基因（bia或ampr），編碼的一種周質(zhì)酶，即β－內(nèi)酰胺酶，可特異地切割氨芐青霉素的β－內(nèi)酰胺環(huán)，從而使之失去殺菌的效力 氯酶素抗性基因（cai或cmlr）編碼的乙酰轉(zhuǎn)移酶，它特異地使氯霉素乙?；Щ?卡那霉素的抗性基因（kan或kanr）編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移霉，可對卡那霉素進行修飾，從而阻止其同核糖體之間發(fā)生相互作用 鏈霉素抗性基因（str或strr）編碼的一種特異性霉，可對鏈霉素進行修飾，從而抑制其同核糖體３０Ｓ亞基的結(jié)合 四環(huán)素抗性基因（tet或tetr）編碼的一種特異性的蛋白質(zhì)，可對細菌的膜結(jié)構(gòu)進行修飾，從而阻止四環(huán)素通過細胞膜從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi) 3儀器: 恒溫搖床， 冰凍離心機，恒溫培養(yǎng)箱， CaCl2轉(zhuǎn)化法 (1) 劃線復(fù)壯宿主菌37℃過夜。棄上清，吸干殘存培養(yǎng)基， CaCl2,重懸菌體，置冰浴1530min。 (3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細胞中，輕旋以混和內(nèi)含物，置于冰上30min。 (6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50℃左右時，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ，搖勻。待出現(xiàn)藍色時取出放在4℃冰箱中，使其顏色更加明顯。一般來說采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高，而平末端或單一酶切位點連接的重組率較低。通過農(nóng)桿菌對植物植株、器官、組織及細胞的侵染進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是將外源基因?qū)肽康闹参锏闹匾椒ㄖ?。隨著科學(xué)家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉(zhuǎn)入目的植物方法發(fā)展較快，現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、細胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學(xué)法及電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是今仍然廣泛使用的一種有效轉(zhuǎn)化方法。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點。發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主時，被損傷的植物細胞會合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，此時其可以與Vir區(qū)A基因的表達產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程。Ori區(qū)的功能：在農(nóng)桿菌中啟動質(zhì)粒DNA的復(fù)制。用XGluc試劑溶液處理該基因轉(zhuǎn)化后的植物組織，通過組織化學(xué)的染色反應(yīng)，來“報道”植物是否被轉(zhuǎn)化，基因是否被導(dǎo)入。這樣轉(zhuǎn)基因植株上收獲的種子，用XGluc試劑溶液處理，籽粒中出現(xiàn)顏色分離。此后間隔5天重復(fù)浸泡。它是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法之后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。微彈復(fù)合體對受體細孢造成的損傷可以修復(fù)。實驗三 轉(zhuǎn)化目的基因的檢測 GUS組織化學(xué)染色實驗?zāi)康恼莆誈US組織化學(xué)染色方法實驗原理適宜的反應(yīng)條件下，β葡聚糖苷酶（GUS）可將XGluc水解成藍色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到。2 放入30度恒溫箱過夜培養(yǎng)。第三章 植物育種分子標記技術(shù)實驗一 RAPD分子標記技術(shù)實驗?zāi)康倪\用PCRRAPD 分子標記技術(shù)，對不同種植物的基因組DNA進行PCR擴增，獲得指紋圖譜。 實驗材料土豆、玉米等農(nóng)作物試劑及儀器10buffer: 500mM KCl 100mM TrisHCl () % 明膠 1% TritonX100MgCl2 ４dNTP: 1mM引物： 3種RAPD引物 模板： 20ng/μlTaq酶： 5u/μlPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng)實驗方法 １．向無菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。實驗原理隨機擴增多態(tài)性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技術(shù)之上的一種分子標記方法，它是以一系列不同隨機排列的寡聚核酸單鏈為引物，對于所研究的基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰氨凝膠或者瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)EB染色來檢測擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。4 第二天鏡檢,白色背景上的藍色斑點既是GUS表達位點。L，保存于20℃。2 可裂膜選用1550psi，將可裂膜、載體膜事先用70％乙醇浸泡半小時，在超凈工作臺晾干。一次可以向數(shù)以千計的細胞導(dǎo)人基因，不受細胞、組織或器官的類型限制，此外其目標命中率高，因此格外受重視。3) 瞬時表達檢測取浸漬后710天的材料：浸泡幾天后就開花了檢測花瓣或新長出的腋芽或柱頭或花蕾下面的嫩葉。而且，可通過卡方測驗，來檢測籽粒顏色分離是否符合孟德爾的分離規(guī)律。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，把Gus基因?qū)胫劣筒说幕ò?，用XGluc試劑溶液處理，花瓣呈藍色反應(yīng)，證明Gus基因已經(jīng)整合至這一植株的染色體中。β葡糖苷酸酶基因，簡稱Gus基因，是從大腸桿菌中分離克隆到的一個基因。其在侵染的過程中轉(zhuǎn)移到寄主的細胞中與其DNA相整合，從而隨寄主細胞中的DNA進行復(fù)制和表達。Vir區(qū)的作用：該區(qū)基因不發(fā)生轉(zhuǎn)移，但它在TDNA轉(zhuǎn)移的過程中起著十分重要的作用，這個區(qū)的缺矢或突變會使發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株喪失對植物的侵染能力。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點：是細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。實驗原理將外源基因人為導(dǎo)入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對植物進行有目的改造，由此獲得轉(zhuǎn)基因植物，其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改變。如果負對照長出菌落說明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對照沒出來，說明感受態(tài)細胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細菌死亡（如涂布時燙死）。 結(jié)果與分析 若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落，說明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化。 (7) 取適量菌液（體積別超過200 ul，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細胞，棄去一部分培養(yǎng)基后，重懸細菌后再涂），加入5ul IPTG（） 和30ul Xgal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻，涂布器應(yīng)涼下來用，否則容易燙死細菌。置冰上12min。棄上清，吸干水， CaCl2重懸菌體。 (2) 。利用此方法僅通過目測就輕而一舉地篩選出重組菌落。兩者之間進行基因內(nèi)互補就產(chǎn)生有活性的β半乳糖苷酶基因。許多載體（如pUC,pBS等）都是帶有包括乳糖操縱子的調(diào)控序列和編碼β半乳糖苷酶前146個氨基酸的基因序列。實驗十 重組DNA的藍白篩選實驗?zāi)康牧私馑{白篩選的基本原理，掌握基本技能實驗原理基因克隆的最后一道工序就是從眾多的轉(zhuǎn)化菌中篩選出目的陽性克隆并鑒定重組子的正確性。材料，試劑和儀器 1 材料:質(zhì)粒載體，插入DNA片段 2 試劑: Promega 公司的T4DNA連接酶試劑盒 3儀器：恒溫水浴鍋 實驗步驟 1 連接 1) 采用20ul的體系，在滅菌的200μlEppendorf管中順序加入： 載體DNA X ul （ ug） PCR產(chǎn)物 X ul （ ug） 10Buffer T4DNA Ligase （） 用ddH2O補足至終體積 10ul . 2）1416℃連接反應(yīng)過夜。 2. 插入片段和載體之間的摩爾比經(jīng)驗值一般為310， 即插入片段要多于載體數(shù)，這樣有利于提高重組率。因為連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，但在此溫度下僅含46bp的退火粘末端之間的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒熱運動的破壞，因此連接溫度應(yīng)介于酶的最適溫度和粘末端退火溫度之間，一般為422℃，平末端連接溫度要更低些。 思考題 1 純化回收DNA的目的是什么? 2 若DNA純化回收后的電泳結(jié)果為兩條帶,那么可能有哪些原因？如何補救？ 實驗九 DNA體外重組實驗?zāi)康牧私釪NA體外重組的基本原理，掌握基本技能實驗原理載體與外源DNA分子體外重組時，如何選擇優(yōu)化連接條件以達到最高的重組率。 9) 去除Minicolumn，將純化的DNA貯存于4℃或20℃。重新連接Syrringe Barrel和 Minicolumn, 加入2mL 80％異丙醇到Syringe中以洗柱子。 2) 用干凈無菌的刀片切割目的DNA條帶， Ep管中，積累凝膠至大約300ul。 10) 沉淀中加入適量無菌雙蒸水混勻。 6) 8 000rpm離心1min，棄上清。 2) 紫外燈下迅速切下目的條帶,放入EP管中。 4) 取上清，加入2倍體積的無水乙醇，20℃沉淀DNA 2hr以上，12 000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于10ul無菌水中，取1ul電泳檢測。當DNA進入低熔點膠中心時停止電泳。實驗八 DNA片段的