【正文】 3 70%酒精脫色224小時(shí)（除去葉綠素），中途換酒精。這種方法操作簡(jiǎn)單，效率高，適應(yīng)性強(qiáng)。農(nóng)桿菌將TDNA轉(zhuǎn)入寄主的過程：首先受傷的植物從傷口處產(chǎn)生特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，與Vir區(qū)A基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程，TDNA區(qū)的兩端先后單鏈短裂，短裂下來的單鏈TDNA被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中與植物的基因組隨機(jī)的整合，Ri質(zhì)粒中移走的TDNA區(qū)通過DNA復(fù)制得到修復(fù)，因此盡管發(fā)生了單鏈TDNA的轉(zhuǎn)移，發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞沒有因此喪失任何遺傳信息。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所使用的質(zhì)粒載體分根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩大類。趁熱倒平板，每板20mL左右，室溫下凝固1015min。若有外源片段插入載體的多克隆位點(diǎn)，則使β半乳糖苷酶基因失活，不能產(chǎn)生α肽，形成白色菌落。 。 8) 將Minicolumn放入一新的離心管中，加入50ul ddH2O或TE到Minicolumn中， 放置1min，10000g，離心20sec。 5) 加入10ul glassmilk混勻 ,室溫靜置5min。3 使用加熱使酶失活應(yīng)視限制性內(nèi)切酶的特性而異；也可使用EDTA使酶失活。曝光時(shí)間短。然后用洗膜液II（SSC, %SDS）6068℃洗兩次，每次15min。DIG（地高辛）、HRP（辣根過氧化物酶）及生物素等, 它們常通過顯色，發(fā)光來顯示雜交信號(hào)。3．紫外光對(duì)人眼有害，觀察時(shí)加蓋玻璃罩，觀察時(shí)間不宜太長(zhǎng)。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)。然而瓊脂中有較多硫酸根，電滲作用大。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。6. 28℃10000g離心15分鐘。 3. 5ΧMOPS 電泳緩沖液(pH ) MOPS mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L (溶液均需用DEPC處理過的水配制)操作步驟方法11. 取幼葉約250 mg在液氮中研磨至細(xì)粉， ml離心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震蕩搖勻； 3. 室溫放置5 min后， ml的氯仿，劇烈搖動(dòng)離心管5 min； 4. 在8℃條件下，12000 rpm離心15 min； 5. 溶液分為兩層，下層為酚－氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管， ml異丙醇在15~30℃條件下，沉淀10 min； 6. 然后在, 2~8℃條件下，12000 rpm離心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液體部分，加入1 ml 75%酒精洗2次； 8. 風(fēng)干后，加入25 181。DNA提取緩沖液主要是由對(duì)DNA有穩(wěn)定作用的鹽如Tris,EDTA和破壞細(xì)胞的試劑SDS或者CTAB組成。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。每使用1ml ，室溫放置10分鐘。常見問題分析：得率低：B. RNA沉淀未完全溶解A260/A280 ：，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。其特點(diǎn)是： (1)水化作用即蛋白質(zhì)分子表面附有能有效防止蛋白質(zhì)分子沉淀析出的水化膜； (2)電荷排斥作用水化膜外還有電荷層(具陰、陽(yáng)離子)能有效地防止蛋白質(zhì)分子的凝集。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 Detection Buffer： TrisHCl、 NaCl及50mmol/L 。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別并水解雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。當(dāng)DNA進(jìn)入低熔點(diǎn)膠中心時(shí)停止電泳。 10) 沉淀中加入適量無菌雙蒸水混勻。 思考題 1 純化回收DNA的目的是什么? 2 若DNA純化回收后的電泳結(jié)果為兩條帶,那么可能有哪些原因？如何補(bǔ)救？ 實(shí)驗(yàn)九 DNA體外重組實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釪NA體外重組的基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理載體與外源DNA分子體外重組時(shí)，如何選擇優(yōu)化連接條件以達(dá)到最高的重組率。實(shí)驗(yàn)十 重組DNA的藍(lán)白篩選實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馑{(lán)白篩選的基本原理，掌握基本技能實(shí)驗(yàn)原理基因克隆的最后一道工序就是從眾多的轉(zhuǎn)化菌中篩選出目的陽(yáng)性克隆并鑒定重組子的正確性。 (2) 。 結(jié)果與分析 若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落，說明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點(diǎn)：是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨(dú)立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，把Gus基因?qū)胫劣筒说幕ò?，用XGluc試劑溶液處理，花瓣呈藍(lán)色反應(yīng)，證明Gus基因已經(jīng)整合至這一植株的染色體中。實(shí)驗(yàn)原理隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技術(shù)之上的一種分子標(biāo)記方法，它是以一系列不同隨機(jī)排列的寡聚核酸單鏈為引物，對(duì)于所研究的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰氨凝膠或者瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)EB染色來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)三 轉(zhuǎn)化目的基因的檢測(cè) GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誈US組織化學(xué)染色方法實(shí)驗(yàn)原理適宜的反應(yīng)條件下，β葡聚糖苷酶（GUS）可將XGluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)，可用肉眼或顯微鏡觀察到。此后間隔5天重復(fù)浸泡。發(fā)根農(nóng)桿菌感染寄主時(shí)，被損傷的植物細(xì)胞會(huì)合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等，此時(shí)其可以與Vir區(qū)A基因的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過程。通過農(nóng)桿菌對(duì)植物植株、器官、組織及細(xì)胞的侵染進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是將外源基因?qū)肽康闹参锏闹匾椒ㄖ弧?(3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕旋以混和內(nèi)含物，置于冰上30min。若有外源基因插入多克隆位點(diǎn)則破壞編碼讀框產(chǎn)生沒活性的α肽段。從分子動(dòng)力學(xué)角度講，后者更為復(fù)雜，且速度也要慢得多，因此平末端的連接效率要低一些為粘末端連接效率的1/101/100。 4) 拔出注射器活塞備用，將 Syringe Barrel和Minicolumn 連接。 3) 離心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于適量的TE或無菌水中，電泳檢測(cè)回收 效果。λDNA是噬菌體的基因組DNA, 是線狀，雙鏈的DNA, , 它的上面有7個(gè)HindⅢ 注：光子的釋放在最初的幾個(gè)小時(shí)達(dá)到高峰，并能維持2448 hr。 將處理好的NC膜用2SSC浸潤(rùn)5min后放到雜交袋中，加入預(yù)雜交液（用Maleic acid Buffer稀釋10封閉液為1封閉液）50－100mL， 65℃預(yù)雜交30min6hr。重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分于質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。試劑：℃下預(yù)冷丙酮(%β巰基乙醇)℃預(yù)冷的80%丙酮(%β巰基乙醇)實(shí)驗(yàn)四 瓊脂糖電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理在凝膠電泳中，首先應(yīng)用的是瓊脂電泳，它具有下列優(yōu)點(diǎn)：（1）瓊脂含液體量 大，可達(dá)9899%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附極微。 5. RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細(xì)胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時(shí)應(yīng)戴手套，并注意時(shí)刻換新手套。，過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于28℃10000g離心10分鐘，取上清。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來時(shí)不被降解。實(shí)驗(yàn)二 RNA的制備和分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握從植物組織中提取RNA的方法實(shí)驗(yàn)原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。2．將勻漿樣品在室溫（1530℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。28℃不超過7500g離心5分鐘，棄上清。4. 在研磨過程中，利用液氮時(shí)刻使組織保持冰凍狀態(tài)。儀器和試劑儀器離心機(jī)、移液器、研缽、離心管、冰箱。（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 3) 加2ul EDTA或65℃加熱10min中止反應(yīng),置－20℃放置備用。曝光448hr。酶對(duì)λDNA分子進(jìn)行酶解，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。 2. 凍融法: 1) 電泳后直接切下凝膠中目的條帶后加200ul TE，再加2倍體積酚，在液氮中 凍2min ，再65℃水浴中融化10min，這樣重復(fù)數(shù)次. 2) 10 000g離心5 min，取上相液加2倍體積100%冰乙醇20℃沉淀過夜。 3) 在裝有凝膠的離心管中加入1mL樹脂， 65℃水浴5min或直到凝膠完全溶解。退火粘末端之間的連接可視為分子內(nèi)的連接，而平末端之間為分子間的連接。并在編碼區(qū)中構(gòu)建了多克隆位點(diǎn)，它不破壞讀框，可使幾個(gè)氨基酸插入到β半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影響功能。放置于4℃用于轉(zhuǎn)化，若不用則加30%甘油置70℃?zhèn)浯?。圖6 藍(lán)白篩選思考題 1 轉(zhuǎn)化的原理是什么?轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)? 2 藍(lán)白篩選的意義和原理?第二章 植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 農(nóng)桿菌浸染的油菜花瓣轉(zhuǎn)化表達(dá)GUS基因試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康霓D(zhuǎn)基因植物在近代工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、特別是農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用越來越為人類所重視。Vir區(qū)7個(gè)基因群（AG）的A一直處于活性表達(dá)狀態(tài)而其它的6個(gè)基因通常情況下處于抑制狀態(tài)。)試劑及配方浸染液：A: 50mmol/L 磷酸鈉緩沖液（）A: 定容100ml B: A取39ml B取61ml 混合定容100ml（500ml的液體培養(yǎng)出來的農(nóng)桿菌可以和1L的緩沖液混合1:2）實(shí)驗(yàn)步驟1) 取浸染液浸染油菜花序，把那些太小的和已經(jīng)開花的去掉，也要去掉腋芽，要浸泡的是含苞欲放的花蕾、花蕾下面的嫩葉及腋芽，浸泡5分鐘。3 每次吸取10風(fēng)DNA－金粉復(fù)合體涂布于載體膜，充分晾干4 選取生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛、大小一致的愈傷組織進(jìn)行轟擊，靶材料距離可裂膜6cm，每皿受體材料轟擊1次。對(duì)于任一特定的RAPD引物，它同基因組DNA序列有特定的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布符合PCR反應(yīng)的條件，即隨機(jī)引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)的位置，且引物的3’端相距在一定的長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，就可以擴(kuò)增出來DNA片段，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA的片段的插入或者缺失，或者堿基突變就能夠?qū)е逻@些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生變化，而使PCR產(chǎn)物增加或者減少，發(fā)生分子量的變化，通過對(duì)于PCR產(chǎn)物的檢測(cè)分析即可以測(cè)出基因組在這些區(qū)域的多態(tài)性。 經(jīng)適當(dāng)處理后，使DNA液均勻地吸附在或包裹于微小的鎢粉或金粉顆粒表面，利用基因槍的火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅(qū)動(dòng)力，發(fā)射出微彈與DNA的復(fù)合體，擊中并高速穿透真空室中受體細(xì)胞的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到將吸附于微彈上的外源DNA導(dǎo)人細(xì)胞或原生質(zhì)體，獲得整合與表達(dá)的目的。(由于Gus基因的插入是隨機(jī)的，而且，不可能同時(shí)插入在一對(duì)同源染色體的同一位點(diǎn)上，因此，染色體上的外源Gus基因在減數(shù)分裂過程中，會(huì)隨同源染色體發(fā)生分離重組。它是非必要的遺傳物質(zhì)，一般控制細(xì)菌的次要性狀，可自我復(fù)制并具有遺傳的穩(wěn)定性，在特殊環(huán)境中對(duì)細(xì)菌的生存起著重要的作用。根據(jù)藍(lán)白的比例可以判斷重組率，根據(jù)菌落數(shù)目可以計(jì)算出轉(zhuǎn)化率。4℃,5000rpm離心5min回收細(xì)胞。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，從而獲得目的基因的大量拷貝，進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能或表達(dá)產(chǎn)物。因此有必要根據(jù)影響連接效率的因素綜合考慮連接條件。 11) 60℃水浴5min。紫外燈下切下目的條帶的低熔點(diǎn)膠。它的識(shí)別位點(diǎn)具有180176。 6．雜交信號(hào)檢測(cè) 1）將雜交膜放入小塑料袋中，有DNA一面朝上，在上面加1mL反應(yīng)底物CSPD。 3儀器：恒溫水浴震蕩器（室溫100℃），雜交袋，水浴鍋，暗盒。PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。為了防止電泳時(shí)兩極緩沖液槽內(nèi)pH和離子強(qiáng)度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內(nèi) 的緩沖液，混勻后再用。故溶液蛋白質(zhì)顆粒(溶質(zhì))呈溶解狀態(tài)；(3)欲提取植物組織中的蛋白質(zhì)必須利用溶解度的差異進(jìn)行分離純化(如鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法、疏水層析、結(jié)晶、加熱、離心分離等法)，利用分子大小和形狀差異進(jìn)行分離純化(分子篩層析法)；還可利用電荷性質(zhì)的差異分離純化(離子交換法)。低離子濃