【正文】 《生物技術(shù)大實驗》實驗指導(dǎo)（試行）四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院64目錄第一章 基因克隆技術(shù)………………………………………………………3實驗一 植物基因組DNA的提取及檢測 ………………………………………………3實驗二 RNA的制備和分析………………………………………………………………6實驗三 蛋白質(zhì)的提取及檢測……………………………………………………………9實驗四 瓊脂糖電泳技術(shù)…………………………………………………………………11實驗五 PCR基因擴(kuò)增及其影響因素分析………………………………………………17實驗六 核酸印跡技術(shù)DIG標(biāo)記探針的分子雜交……………………………………20實驗七 λDNAHindⅢ酶切鑒定…………………………………………………………24實驗八 DNA片段的純化回收…………………………………………………………26實驗九 DNA體外重組…………………………………………………………………29實驗十 重組DNA的藍(lán)白篩選…………………………………………………………31第二章 植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)………………………………………………35實驗一 農(nóng)桿菌浸染的油菜花瓣轉(zhuǎn)化表達(dá)GUS基因試驗……………………………35實驗二 基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化實驗……………………………………………………38實驗三 轉(zhuǎn)化目的基因的檢測 GUS組織化學(xué)染色……………………………………39第三章 植物育種分子標(biāo)記技術(shù)………………………………………40實驗一 RAPD分子標(biāo)記技術(shù)……………………………………………………………36實驗二 SSR分子標(biāo)記技術(shù)（包括垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳）………………………43實驗三 SNP分子標(biāo)記技術(shù)………………………………………………………………47第四章 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)………………………………………………49 實驗一 大腸桿菌菌種的活化和菌種的保存……………………………………………49實驗二 感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaC12 法制備感受態(tài)細(xì)胞…………………………50實驗三 堿式裂解法提取表達(dá)載體質(zhì)?！?2實驗四 大腸桿菌的熱激轉(zhuǎn)化法…………………………………………………………54實驗五 Taq聚合酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)……………………………………………………55實驗六 Taq聚合酶的提取純化…………………………………………………………57實驗七 SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Taq聚合酶分子量及純度………………58實驗八 Taq聚合酶活性單位標(biāo)定和比活性檢測………………………………………60第五章 生物信息數(shù)據(jù)庫及生物軟件的使用…………………61實驗一 NCBI等數(shù)據(jù)庫的使用…………………………………………………………61實驗二 常用生物軟件的使用……………………………………………………………63第一章 基因克隆技術(shù)實驗一 植物基因組DNA的提取及檢測實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)和掌握從植物組織中提取DNA的方法實驗原理基因組DNA的提取包括組織粉碎，細(xì)胞膜破壞，其DNA含量豐富，組織易于破碎。組織破碎方法有很多種，可以研磨，搗碎機(jī)搗碎，超低溫冷凍使組織細(xì)胞間結(jié)冰，稍加研磨即可以粉碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。DNA提取緩沖液主要是由對DNA有穩(wěn)定作用的鹽如Tris,EDTA和破壞細(xì)胞的試劑SDS或者CTAB組成。蛋白質(zhì)的去除是用苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異丙醇或無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase處理去除少量的RNA，即得植物總DNA溶液。實驗材料玉米、馬鈴薯等農(nóng)作物葉片試劑配方1. CTAB 抽提緩沖液Table 1 CTAB Extraction Buffer (100ml)*1 M TrisHcl pH NaCl M CTAB BME ml ml g ml* Use freshly made. Warm buffer to 6065℃ before adding CTAB (cetyltriethylammonium bromide) and BME (βmercaptoethanol). Add BME just prior to use under a fume hood.2. 氯仿/異戊醇（24:1,v/v）: 將氯仿和異戊醇按體積24:1的比例混勻，置棕色瓶中，4℃保存。實驗步驟1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves after darkness treatment of several days, although older leaves that are not senescent may be used.2. Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze). Samples may be stored at 80℃ until ready to continue the following steps.NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4.3. Remove mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar prefrozen, add liquid nitrogen, grind to a fine powder with a prefrozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4. Add 2 ml warm (65℃) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle inversion.5. Incubate in a 65℃ water bath for 3040 min, mixing gently by inversion every 10 min. NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 69 under a fume hood. 6. Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for 15 min.7. Spin in a tabletop centrifuge with 8000~10000 rpm at room temperature for 15 min. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.NOTE: Below 15℃ the CTAB and nucleic acid plex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge.8. Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.9. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix well and keep at 20℃ for at least 10 min to separate out the DNA.10. Use a pin to hook out the DNA. Rinse it with icecold 70% ethanol twice and absolute ethanol once.11. Dry pellet in vacuum desiccator with middle speed for 10 min.12. Dissolve the DNA in 50 μl HPLC H2O. (Add 3 μl of 10mg/ml RNase A (preboiled), mix by gentle inversion and incubate at 37℃ for 30 min.)13. Dilute 50500 times and read absorbance at 260 nm and 280 nm in spectrophotomemter and calculate concentration and quality. 14. Store at 4℃ for use or 20℃ for a long time.注意事項 1. 葉片磨得越細(xì)越好 2. 移液器的使用 3. 由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。實驗二 RNA的制備和分析實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)和掌握從植物組織中提取RNA的方法實驗原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來時不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。材料玉米、水稻、小麥等農(nóng)作物根或葉儀器試劑(一) 儀器 1． 低溫離心機(jī) 2． 分光光度計 3． 瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1% Na OH溶液浸泡過夜，之后再用DEPC水浸泡沖洗。 4． 高壓滅菌鍋 5． 研缽、剪刀、一次性手套等 (二) 藥品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 異硫氰酸胍 4. 醋酸鈉(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 瓊脂糖 11. 異丙醇 (三) 試劑配方 1． % DEPC水 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。 2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、4 mol/L異硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。 3. 5ΧMOPS 電泳緩沖液(pH ) MOPS mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L (溶液均需用DEPC處理過的水配制)操作步驟方法11. 取幼葉約250 mg在液氮中研磨至細(xì)粉， ml離心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震蕩搖勻； 3. 室溫放置5 min后， ml的氯仿，劇烈搖動離心管5 min； 4. 在8℃條件下，12000 rpm離心15 min； 5. 溶液分為兩層，下層為酚－氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管， ml異丙醇在15~30℃條件下，沉淀10 min； 6. 然后在, 2~8℃條件下，12000 rpm離心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液體部分，加入1 ml 75%酒精洗2次； 8. 風(fēng)干后，加入25 181。l DEPC處理過的水溶解RNA，儲藏于80℃冰箱備用。方法21. 勻漿處理: 將組織在液氮中磨碎,每50100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積()加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有how(event) class=t_tagDNA污染。c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每510106動物、植物、酵母細(xì)胞或1107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。2．將勻漿樣品在室溫（1530℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于28℃10000g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。5. 每使用1ml ，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。6. 28℃10000g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml ，室溫放置10分鐘。8. 28℃10000g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。28℃不超過7500g離心5分鐘，棄上清。