【正文】 ，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。℅SDS,用槍頭吸打幾次,5560℃,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，70℃保存。注意事項1. 從少量樣品（110mg組織或102104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加510μg RNasefree糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在60至70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中28℃一星期以上或5至20℃一年以上。3. 分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600g離心3060分鐘。預期產(chǎn)量：1mg組織或1106細胞提取RNA分別為：肝和脾610μg ,腎34μg , ,胎盤14μg ,上皮細胞815μg ,成纖維細胞57μg 。常見問題分析：得率低：B. RNA沉淀未完全溶解A260/A280 ：，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高B．樣品勻漿時加的試劑量太少C. 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘D. 吸取水相時混入了有機相E .RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：B. 待提取RNA的樣品沒有保存于60至70℃,而保存在了5至20℃C. 細胞在用胰酶處理時過度D. 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理E. DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少B. 樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml ( NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。4. 在研磨過程中，利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態(tài)。 5. RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時應戴手套，并注意時刻換新手套。思考題 1. 實驗中使用的各種藥品的作用？ 2. 真核生物的總RNA提純后，可以繼續(xù)做那些工作？ 3. DNA和RNA相比，為什么說提純植物細胞的mRNA是研究結(jié)構(gòu)基因更關(guān)鍵的一步實驗三 蛋白質(zhì)的提取及檢測實驗目的熟悉植物葉蛋白的幾種提取原理和方法，了解其意義及其應用價值。實驗原理以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、干燥和保存。植物葉蛋白或稱綠色蛋白濃縮物(leafproteinconcentration，簡稱LPC)，是從新鮮植物葉片中提取的高質(zhì)量濃縮蛋白質(zhì)，不僅是畜禽生長發(fā)育和生產(chǎn)畜產(chǎn)品的主要營養(yǎng)物質(zhì)，而且目前也正成為人類的保健營養(yǎng)理想食品之一。天然蛋白存在于為數(shù)甚多的植物體內(nèi)，對其分離應依據(jù)人們的利用目的及提取蛋白含量和品質(zhì)加以考慮。天然蛋白質(zhì)一般在溶液中呈穩(wěn)定的親水膠體狀態(tài)，故LPC亦稱葉蛋白膠。其特點是： (1)水化作用即蛋白質(zhì)分子表面附有能有效防止蛋白質(zhì)分子沉淀析出的水化膜； (2)電荷排斥作用水化膜外還有電荷層(具陰、陽離子)能有效地防止蛋白質(zhì)分子的凝集。故溶液蛋白質(zhì)顆粒(溶質(zhì))呈溶解狀態(tài)；(3)欲提取植物組織中的蛋白質(zhì)必須利用溶解度的差異進行分離純化(如鹽析、有機溶劑分級沉淀法、疏水層析、結(jié)晶、加熱、離心分離等法)，利用分子大小和形狀差異進行分離純化(分子篩層析法)；還可利用電荷性質(zhì)的差異分離純化(離子交換法)。只要創(chuàng)造上述影響因素，即可使蛋白質(zhì)從植物葉片中分離并沉淀出來。植物葉蛋白提取一般遵循如下基本原則：盡可能提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；破壞蛋白與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。根據(jù)該原則，植物葉蛋白制備過程中一般需要有四種試劑①離液劑：尿素和硫脲等；②表面活性劑：又稱去垢劑，早期常用NPTritonx100等非離子型去垢劑，離子型去垢劑有SDS、膽酸鈉、LiDS等，還有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以凍存)與Zwittergent等雙性離子去垢劑；③還原劑：DTT、DTE、TBP、Trisbase等；④蛋白酶抑制劑及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物(Proteaseinhibitorcocktails)等，如為了去除緩沖液中存在的痕量重金屬離子，～5mmol/LEDTA，同時使金屬蛋白酶失活。儀器和試劑儀器離心機、移液器、研缽、離心管、冰箱。試劑：℃下預冷丙酮(%β巰基乙醇)℃預冷的80%丙酮(%β巰基乙醇)實驗四 瓊脂糖電泳技術(shù)實驗目的通過本實驗學習和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)實驗原理在凝膠電泳中，首先應用的是瓊脂電泳，它具有下列優(yōu)點：（1）瓊脂含液體量 大，可達9899%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小，對蛋白質(zhì)的吸附極微。（2）瓊脂作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復性好等優(yōu)點。（3）電泳速度快。（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。然而瓊脂中有較多硫酸根，電滲作用大。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的， 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。瓊脂（糖）電泳常用緩沖液的pH在69之間。離子強度過高時，會有大量電流通過凝膠，因而產(chǎn)生熱量，使凝膠的水份量蒸發(fā)，析出鹽的結(jié)晶，甚至可使凝膠斷裂，電流中斷。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。為了防止電泳時兩極緩沖液槽內(nèi)pH和離子強度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內(nèi) 的緩沖液，混勻后再用。天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下。（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術(shù)。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和純化DNA片段一種方法和技術(shù)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分于質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。DNA經(jīng)溴乙錠（EB）染色，溴乙錠可以插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)兩個堿基之間，與核酸形成絡(luò)合物，在紫外（300nm,360nm）激發(fā)下，產(chǎn)生桔黃色熒光（590 nm可見光）。線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系瓊脂糖凝膠的百分濃度（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（kb）60~520~110~7~6~4~3~Amount of Agarose and TBE buffer for Typical Gel Sizes and Electrophoresis ParametersAgarose concentrationGel sizeAgarose1 TBE bufferSample volume/wellElectrophoresisVoltmATime% for Genomic DNA.68cm25ml10μl152015h1114cm75ml20μl152015h1120cm150ml20μl152015h2025cm300ml20μl152015h% for fragments from 200 to 3500bp such as STSs.1114cm75ml20μl25301224cm150ml18μl25302025cm200ml20μl25302424cm300ml16μl25302% for RAPDs.1114cm75ml20μl35401224cm150ml18μl35402025cm200ml20μl35402424cm300ml16μl35403% for fragments below 400bp such as plasimds, probe inserts or SSRs (Proportion of Metaphor agarose:Seakem agarose=2:1 or : for fine separation and resolution).1114cm75ml20μl10023h1224cm150ml18μl10023h1224cm120ml12μl10023h2025cm200ml20μl10023h2424cm300ml16μl10023h試劑配方1. 10TBE, TBETable 10 TBE Gel Buffer ( M Tris, 20 mM EDTA)Stock1 Liter3 Liter5 LiterTris base (MW=)Boric Acid (MW=) M EDTA pH * pH to with glacial acetic acid. A precipitate may form when stored for long periods of time.2. 凝膠載樣緩沖液： %溴酚藍，40%（m/V）蔗糖水溶液, 4℃保存protocols:15. Melt agarose in microwave oven, keeping covered to avoid evaporation and mixing vigorously several times during heating. Make sure all the agarose is dissolved (it takes longer to dissolve than lower concentrations). The solution surface can be marked before heating and add dH2O up to the mark after heating, or weigh again after heating and make up for the evaporated weight with dH2O. Heat up one more time. 16. Apply some vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small bubbles created by much mixing.17. Cool to about 55℃ (if desired, the flask can be placed into cool water to speed cooling), pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert bs and