生化實驗技術綜合設計性大實驗(編輯修改稿)
2025-02-02 17:57 本頁面
【文章內容簡介】 性谷胱甘肽等） 3．抑制水解酶的作用 (SDS,EDTA) 4．其他保護措施 (避免過酸過堿和劇烈攪拌 ） （三）生化物質的提取 一般生產上多用 2～ 3次 提取 。 溶劑用量 （ L） 為生物材料的 2～ 5倍 ， 少數(shù)情況也有用 10～ 20倍量溶劑作一次性提取 。 目的是節(jié)省提取時間 ， 降低有害酶的作用 。 二、影響提取的因素 （－）溫度 （二）酸堿度 （三）鹽濃度 三、提取方法 （一）用酸、堿、鹽水溶液提取 （二）用表面活性劑提取 （三）有機溶劑提取 對 酸性 物質的提取，常在 堿性 條件下進行；對 堿性 物質的提取，常在酸性 條件下進行；對 兩性 物質的提取，則使水溶液的 pH值在遠離該兩性物質的 等電點 為佳。 （三）超臨界氣體的萃取技術 以氣體為萃取劑，當氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質。 氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學穩(wěn)定性好，價廉易得等特點。主要有 二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷 等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調節(jié)分離萃取劑與被萃取物。 該技術應用于酶 、 不飽和脂肪酸的提取 （ 如 魚油和卵磷脂 的提取 ） 、 精制和回收 ， 也可用于生化產品的溶劑脫除 。某些生化產品在生產過程中 ， 采用了丙酮和甲醇溶劑 ， 欲脫去溶劑又要避免產品的分解 ， 需選擇超臨界氣體提取 。 與減壓干燥法相比較 ， 前者不多消耗能源 ，且縮短脫溶時間 。 四、提取液的分離 提取所得到的溶液 ， 需與固體或另一液體分離 。 溶液與固體的分離 ， 一般處理方法有三種： 自然沉降 、 過濾 、 離心 。 自然沉降是在液體介質中 ， 固體自然下沉而分離的過程 。 當混懸液處理量較大 ， 且固體和液體的比重懸殊時 ， 可用此法 。 沉降分層后 ， 可用虹吸等方法將液體部分移去 。 過濾系利用多孔材料阻留固體 ， 而使液體通過 ， 達到固體與液體分離的過程 。 離心是利用旋轉運動的離心力進行分離物料的一種操作 ， 其中通過過濾介質分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離； 利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降 。 生化物質的分離純化技術 生化物質分離純化技術包括： 生化產品的分離分析和生化產品的制備 。 前者主要對生物體內各組份加以分離后進行定性、定量鑒定，它不一 定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內某一單純組分。 為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物產品的制備中的分離方法多采用溫和的“ 多階式 ”方法進行，即常說的“ 逐級分離 ”方法。 為了純化一種生化物質常常要聯(lián)合幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。因此操作的時間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。 親和層析法 具有從復雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應用。 （一）分離純化原理 （ 1） 根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離 。 如差速離心與超離心 ， 膜分離 （ 透析 、 電滲析 ） 與超濾法 ， 凝膠過濾法 。 （ 2） 根據(jù)分子電離性質 （ 帶電性 ） 的差異進行分離 。 如離子交換法 ， 電泳法 ， 等電聚焦法 。 （ 3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。 （ 4）根據(jù)物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。 （ 5）根據(jù)配體特異性進行分離 —— 親和層析法。 （二）分離純化的程序和生產設計 （ 1）確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法； （ 2）制備物的理化性質穩(wěn)定性的預備試驗； （ 3）材料處理及抽提方法的選擇； （ 4）分離純化方法的摸索； （ 5）產物的均一性測定。 1．分離純化初期使用方法的選擇 早期分離純化用萃取 ， 沉淀 ， 吸附等一些分辨力低的方法較為有利 ， 這些方法負荷能力大 ， 分離量多兼有分離提純和濃縮作用 ， 為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎 。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且 負荷量較大者為合適 ，但隨著許多新技術的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。 2．各種分離純化方法的使用程序 生化物質的分離都是在液相中進行 ， 故分離方法主要根據(jù)物質的分配系數(shù) ， 分子量大小 ， 離子電荷性質及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎 。 例如純化其一兩性物質時 ， 前一步已利用該物質的陰離子性質 ， 使用了陰離子交換層析法 ，下一步提純時再應用其陽離子性質作層析或電泳分離便會取得較好分離效果 。 如有些雜質在各種條件下帶電荷性質可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質
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