生化實驗技術(shù)綜合設(shè)計性大實驗(編輯修改稿)
2025-02-02 17:57 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 性谷胱甘肽等） 3．抑制水解酶的作用 (SDS,EDTA) 4．其他保護措施 (避免過酸過堿和劇烈攪拌 ） （三）生化物質(zhì)的提取 一般生產(chǎn)上多用 2～ 3次 提取 。 溶劑用量 （ L） 為生物材料的 2～ 5倍 ， 少數(shù)情況也有用 10～ 20倍量溶劑作一次性提取 。 目的是節(jié)省提取時間 ， 降低有害酶的作用 。 二、影響提取的因素 （－）溫度 （二）酸堿度 （三）鹽濃度 三、提取方法 （一）用酸、堿、鹽水溶液提取 （二）用表面活性劑提取 （三）有機溶劑提取 對 酸性 物質(zhì)的提取，常在 堿性 條件下進行；對 堿性 物質(zhì)的提取，常在酸性 條件下進行；對 兩性 物質(zhì)的提取，則使水溶液的 pH值在遠(yuǎn)離該兩性物質(zhì)的 等電點 為佳。 （三）超臨界氣體的萃取技術(shù) 以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質(zhì)。 氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學(xué)穩(wěn)定性好，價廉易得等特點。主要有 二氧化碳、氮氣、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷 等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。 該技術(shù)應(yīng)用于酶 、 不飽和脂肪酸的提取 （ 如 魚油和卵磷脂 的提取 ） 、 精制和回收 ， 也可用于生化產(chǎn)品的溶劑脫除 。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中 ， 采用了丙酮和甲醇溶劑 ， 欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解 ， 需選擇超臨界氣體提取 。 與減壓干燥法相比較 ， 前者不多消耗能源 ，且縮短脫溶時間 。 四、提取液的分離 提取所得到的溶液 ， 需與固體或另一液體分離 。 溶液與固體的分離 ， 一般處理方法有三種： 自然沉降 、 過濾 、 離心 。 自然沉降是在液體介質(zhì)中 ， 固體自然下沉而分離的過程 。 當(dāng)混懸液處理量較大 ， 且固體和液體的比重懸殊時 ， 可用此法 。 沉降分層后 ， 可用虹吸等方法將液體部分移去 。 過濾系利用多孔材料阻留固體 ， 而使液體通過 ， 達(dá)到固體與液體分離的過程 。 離心是利用旋轉(zhuǎn)運動的離心力進行分離物料的一種操作 ， 其中通過過濾介質(zhì)分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離； 利用液固兩相比重的差異進行沉降分離者為離心沉降 。 生化物質(zhì)的分離純化技術(shù) 生化物質(zhì)分離純化技術(shù)包括： 生化產(chǎn)品的分離分析和生化產(chǎn)品的制備 。 前者主要對生物體內(nèi)各組份加以分離后進行定性、定量鑒定，它不一 定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。 為了保護目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物產(chǎn)品的制備中的分離方法多采用溫和的“ 多階式 ”方法進行，即常說的“ 逐級分離 ”方法。 為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)合幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達(dá)到目的。因此操作的時間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。 親和層析法 具有從復(fù)雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應(yīng)用。 （一）分離純化原理 （ 1） 根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離 。 如差速離心與超離心 ， 膜分離 （ 透析 、 電滲析 ） 與超濾法 ， 凝膠過濾法 。 （ 2） 根據(jù)分子電離性質(zhì) （ 帶電性 ） 的差異進行分離 。 如離子交換法 ， 電泳法 ， 等電聚焦法 。 （ 3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法及有機溶劑分級沉淀法。 （ 4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。 （ 5）根據(jù)配體特異性進行分離 —— 親和層析法。 （二）分離純化的程序和生產(chǎn)設(shè)計 （ 1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法； （ 2）制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗； （ 3）材料處理及抽提方法的選擇； （ 4）分離純化方法的摸索； （ 5）產(chǎn)物的均一性測定。 1．分離純化初期使用方法的選擇 早期分離純化用萃取 ， 沉淀 ， 吸附等一些分辨力低的方法較為有利 ， 這些方法負(fù)荷能力大 ， 分離量多兼有分離提純和濃縮作用 ， 為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ) 。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且 負(fù)荷量較大者為合適 ，但隨著許多新技術(shù)的建立，一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質(zhì)的變性危險愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。 2．各種分離純化方法的使用程序 生化物質(zhì)的分離都是在液相中進行 ， 故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù) ， 分子量大小 ， 離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎(chǔ) 。 例如純化其一兩性物質(zhì)時 ， 前一步已利用該物質(zhì)的陰離子性質(zhì) ， 使用了陰離子交換層析法 ，下一步提純時再應(yīng)用其陽離子性質(zhì)作層析或電泳分離便會取得較好分離效果 。 如有些雜質(zhì)在各種條件下帶電荷性質(zhì)可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質(zhì)的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質(zhì)
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