生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合設(shè)計(jì)性大實(shí)驗(yàn)-文庫吧資料
2025-01-12 17:57本頁面
【正文】 3．分離后期的保護(hù)性措施 在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失 ，主要損失途徑是器皿的吸附 ， 操作過程樣品液體的殘留 ， 空氣的氧化和某些事先無法了解的因素 。 在安排純化方法順序時(shí) ， 還要考慮到有利于減少工序 ， 提高效率 ， 如在鹽析后采取吸附法 ， 必然會因離子過多而影響吸附效果 ， 如增加透析除鹽 ， 則使操作大大復(fù)雜化 。 例如純化其一兩性物質(zhì)時(shí) ， 前一步已利用該物質(zhì)的陰離子性質(zhì) ， 使用了陰離子交換層析法 ，下一步提純時(shí)再應(yīng)用其陽離子性質(zhì)作層析或電泳分離便會取得較好分離效果 。 早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且 負(fù)荷量較大者為合適 ，但隨著許多新技術(shù)的建立，一個(gè)特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質(zhì)的變性危險(xiǎn)愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動電泳、連續(xù)流動等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。 （二）分離純化的程序和生產(chǎn)設(shè)計(jì) （ 1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法； （ 2）制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)； （ 3）材料處理及抽提方法的選擇； （ 4）分離純化方法的摸索； （ 5）產(chǎn)物的均一性測定。如選擇性吸附與吸附層析法。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點(diǎn)沉淀法及有機(jī)溶劑分級沉淀法。 如離子交換法 ， 電泳法 ， 等電聚焦法 。 如差速離心與超離心 ， 膜分離 （ 透析 、 電滲析 ） 與超濾法 ， 凝膠過濾法 。 親和層析法 具有從復(fù)雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點(diǎn)，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應(yīng)用。 為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)合幾個(gè)，甚至十幾個(gè)步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達(dá)到目的。 前者主要對生物體內(nèi)各組份加以分離后進(jìn)行定性、定量鑒定，它不一 定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。 離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力進(jìn)行分離物料的一種操作 ， 其中通過過濾介質(zhì)分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離； 利用液固兩相比重的差異進(jìn)行沉降分離者為離心沉降 。 沉降分層后 ， 可用虹吸等方法將液體部分移去 。 自然沉降是在液體介質(zhì)中 ， 固體自然下沉而分離的過程 。 四、提取液的分離 提取所得到的溶液 ， 需與固體或另一液體分離 。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中 ， 采用了丙酮和甲醇溶劑 ， 欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解 ， 需選擇超臨界氣體提取 。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。 氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學(xué)穩(wěn)定性好，價(jià)廉易得等特點(diǎn)。 （三）超臨界氣體的萃取技術(shù) 以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時(shí)，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。 目的是節(jié)省提取時(shí)間 ， 降低有害酶的作用 。 （ 二 ） 活性物質(zhì)的保護(hù)措施 1．采用緩沖系統(tǒng) 2．添加保護(hù)劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等） 3．抑制水解酶的作用 (SDS,EDTA) 4．其他保護(hù)措施 (避免過酸過堿和劇烈攪拌 ） （三）生化物質(zhì)的提取 一般生產(chǎn)上多用 2～ 3次 提取 。 生化物質(zhì)的提取 利用一種溶劑對不同物質(zhì)溶解度的差異 ，從混合物中分離出一種或幾種組分的過程稱為提取 （ extraction） ， 提取又稱萃取或抽提 ， 其含義基本相同 。 表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造 DNA時(shí)，采用 pH8的 ／ L三羥甲基氨基甲烷（ Tris）－ ／ L乙二胺四乙酸（ EDTA）制成每毫升含 2億個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后加入 100μg — 1mg的溶菌酶，在 37℃ 保溫 10min，細(xì)菌胞壁即被破壞；還有把 蝸牛酶 用于酵母細(xì)胞的破碎；用 胰酶 處理豬腦制備腦安素。 因自溶的時(shí)間較長 ， 不易控制 ，故制造具有活性的核酸 、 蛋白質(zhì)時(shí)比較少用 。 自溶的溫度 ， 動物材料選在0～ 4℃ ， 微生物材料則多在室溫下進(jìn)行 。 多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備 。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。用大腸桿菌制備各種酶時(shí)，常用 50～ 100mg／ L菌體的濃度，在1KHz～ 10KHz（千赫茲）頻率下處理 10～15min。操作時(shí)，將材料投入沸水中，在 90℃ 左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。 (一 )機(jī)械法 (二 )物理法 把待破碎的樣品冷至 － 15～－ 20℃ ，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分動物性的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑椤?粉碎少量原料時(shí) ， 可使用高速組織搗碎機(jī) （ 10 000r／ min） 、 勻漿器 、 研缽 、 研船等 。 如果提取的有效成分是體液或細(xì)菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細(xì)胞。 不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。 用枯草桿菌或酵母菌作宿主菌，雖可解決這一矛盾，但表達(dá)的蛋白質(zhì)成分仍有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷；用 動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞 表達(dá)則能比較好地解決后處理及完整表達(dá)的問題。 7．對生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求 選擇生物技術(shù)產(chǎn)品
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