【正文】 2； 10 mL 2； （ 7）離心機(jī)； （ 8）恒溫水浴 ； （ 9）分光光度計(jì)。以單位時(shí)間產(chǎn)生麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。 淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用 3， 5 一二硝基水楊酸試劑測(cè)定。通常提取液中同 時(shí)有兩種淀粉酶存在，測(cè)定時(shí)，可根據(jù)它們的特性分別加以處理，鈍化其中之一，既可測(cè)出另一酶的活性。 本實(shí)驗(yàn)的目的在于掌握分別測(cè)定這兩種淀粉酶的方法。淀粉酶幾乎存在于所有植物中，其中以禾谷類種子的淀粉酶活性最強(qiáng)。 五、結(jié)果 1. 顯色后照相或繪圖記錄層析圖譜，也可用 CS— 930 進(jìn)行掃描其展層圖譜。取出玻璃板以吹風(fēng)機(jī)吹干。 3. 面粉提取液中可溶性糖的分離鑒定 取活化過的硅膠 G 玻板一塊，在距底邊 1． 5cm 水平線上確定 5 個(gè)點(diǎn)，相互間隔1cm 其中 4 個(gè)點(diǎn)分別點(diǎn)上木糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各 3μ L 或適量，另一個(gè)點(diǎn)點(diǎn)上面粉提出液 3μ L或適量。 2. 面粉中可溶性糖提取液的制備 稱取小麥面粉 5g，放入 100mL燒杯中，加入 40mL 水?dāng)噭颍糜?50℃恒溫水浴中浸提 1h。 四、操作步驟 1. 硅膠 G 薄板的制備 稱取硅膠 G粉 30g，羧甲基纖維素鈉 ，加入 ，于研缽充分研磨，傾入涂布器中，薄層的厚度為 ，即將調(diào)節(jié)檔放在涂布器的紅線處，待硅膠 G 開始變稠時(shí)，將操縱桿扣過去，可鋪 20X20cm 薄板 5 塊。 2．儀器 （ 1）離心機(jī)及大離心管 （ 2）藥物天平 （ 3）大研缽 （ 4）蒸發(fā)皿 （ 5）燒杯： 100mL 1 （ 6）量筒： 100mL （ 7）恒溫水浴 （ 8）層析缸 （ 9）微量點(diǎn)樣器 （ 10）吹風(fēng)機(jī) （ 11）玻璃板 2020cm （ 12）涂布器 （ 13）烘箱 （ 14）噴霧器 3．試劑 （ 1） ：稱 溶解后定容至 1 000mL；每組 30mL。根據(jù)吸附層析原理，極性不同的糖在硅膠 G 層上展層時(shí)，具有不同的 Rf值，通過比較，可分離鑒定植物樣品提取液中糖的種類。 各種糖羥基多少不同，造成吸附力的差異。糖為多羥基化合物。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)提取植物材料中可溶性糖的一般方法，掌握薄層層析的原理、技術(shù)及其在糖類定性鑒定中的應(yīng)用。分離鑒定植物組織中可溶性糖的種類及其變化，對(duì)于了解植物體內(nèi)物質(zhì)代謝和農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，具有重要意義。 21 第四章 生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 實(shí)驗(yàn)一 可溶性糖的硅膠 G 薄層層析 一、目的 糖類是自然界存在的數(shù)量非常多的有機(jī)化合物。 （ 5）各點(diǎn)分布均勻。 20 （ 4）用清楚的設(shè)計(jì)符號(hào)： ■□?????● 。 （ 2）自變量放在橫軸（ X）上，應(yīng)變量放在縱軸上（ Y）。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告的基本格式及注意點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)（編號(hào)） 實(shí)驗(yàn)名稱 姓名 日期 頁數(shù) （ 1） 目的 （ 2） 原理 （ 3） 試劑和儀器 （ 4） 操作方法 （ 5） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （ 6） 討論 圖表問題： 表的規(guī)范：三線表 表 X ======================================= 項(xiàng)目 A（單位） B（單位） 1 2 注： ====================== 圖的規(guī)范： 在許多實(shí)驗(yàn)中，都有一個(gè)量（如溫度、濃度、 pH 等）在不斷變化，稱自變量；要測(cè)量的是此量對(duì)另一 個(gè)量的影響，稱應(yīng)變量。 舍棄商 Q 的數(shù)值（置信概率為 90%）表 測(cè)定次數(shù) 3 4 5 6 7 8 9 10 如舍棄后仍有被懷疑的可疑值時(shí)，可再次進(jìn)行檢查。 基本步驟：將數(shù)據(jù)排序并計(jì)算極差 找出可疑值與近鄰值的差用極差除可疑值與其近鄰值之差得到舍棄商（ rejection quotient）值 Q 查 Q 值表。否則應(yīng)保留。 （ 8）表示準(zhǔn)確度和精確度時(shí)一般只取一位有效數(shù)字。 （ 6）在對(duì)數(shù)運(yùn)算中，所取對(duì)數(shù)位數(shù)應(yīng)與真數(shù)有效數(shù)字位數(shù)相等。 在進(jìn)行大量數(shù)據(jù)的運(yùn)算時(shí)，為使誤差不迅速積累，可多保留一位有效數(shù)字，可多保留的有效數(shù)字叫“安全數(shù)字”。 （ 3）第一位有效數(shù)字大于或第于 8 時(shí)，有效數(shù)字的 位數(shù)可多算一位。常用的基本規(guī)則是： （ 1）記錄測(cè)定數(shù)值時(shí)，只保留一位可凝數(shù)字。 如果數(shù)據(jù)中有“ 0”，應(yīng)根據(jù)具體情況分析哪些“ 0”是有效數(shù)字。 例： 坩堝質(zhì)量 六位有效數(shù)字 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積 四位有效數(shù)字 萬分之一天平精度為 ，滴定管讀數(shù)能精確到 。在記錄和計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)該保留幾位有效數(shù)字須根據(jù)測(cè) 量方法和使用的儀器準(zhǔn)確程度來決定。 （ 3）校準(zhǔn)儀器 了解儀器的使用條件，熟悉儀器的操作環(huán)境，經(jīng)常對(duì)儀器進(jìn)行預(yù)先校正，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中利用校正值。 系統(tǒng)誤差可通過以下方法減小： （ 1）對(duì)照實(shí)驗(yàn) 在測(cè)量前，利用標(biāo)準(zhǔn)試樣來檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度。 絕對(duì)偏差 = 測(cè)得值 – 測(cè)得平均值 相對(duì)偏差 = 絕對(duì)偏差 /測(cè)得平均值 100% 相對(duì)平均偏差： 設(shè)： m1； m2； mn 算數(shù)平均值為 M 算數(shù)平均偏差為： =（︱ m1M︱ +︱ m2M︱ ︱ mnM︱）/n 相對(duì)平均偏差（ %） = /M 100% 標(biāo)準(zhǔn)偏差： S= 3．提高分析準(zhǔn)確度的方法 提高分析準(zhǔn)確度就是要 盡可能地減小系統(tǒng)誤差和偶然誤差。精確度用“偏差”來表示，偏差越小，精確度越高。但因真實(shí)值是不可知的，所以實(shí)際工作中無法求準(zhǔn)確度，一般用精確度來評(píng)價(jià)分析結(jié)果。 2．誤差的表示方法 （ 1）準(zhǔn)確度與誤差 誤差可分為絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差 2 種： 絕對(duì)誤差（ ? N） = 測(cè)定值（ N） 真實(shí)值（ N/） 相對(duì)誤差（ %） =? N/ N/ 100% 例：用天平稱兩種蛋白質(zhì)的質(zhì)量各為 和 ，假定兩者的真實(shí)值各為 和 ，則稱量的絕對(duì)誤差和相對(duì)誤差分別為： 絕對(duì)誤差： = （ g） = （ g） 相對(duì)誤差分： 可見在用相對(duì)誤差表示時(shí)，兩種稱量方法的準(zhǔn)確度相差 10倍。即，大小相等的正負(fù)誤差出現(xiàn)的幾率相等；小誤差出現(xiàn)的幾會(huì)多，大誤差出現(xiàn)的幾會(huì)少。 （ 2）偶然誤差 由于某些偶然因素（如測(cè)定時(shí)的環(huán)境溫度、濕度、氣壓等的微小波動(dòng)，儀器性能的 微小變化等）所引起的。下章將通過統(tǒng)計(jì)分析（其中最主要是回歸分析），可以發(fā)現(xiàn)更好的工藝條件。 表 8 制備阿魏酸的試驗(yàn)方案 ? ?3*7 7U 和結(jié)果 No. 配比（ A） 吡啶量（ B） 反應(yīng)時(shí)間（ C） 收率（ Y） 1 (1) 13(2) (3) 2 (2) 19(4) (6) 3 (6) 25(6) (2) 4 (1) 10(1) (5) 5 (5) 16(3) (1) 6 (6) 22(5) (4) 7 (7) 28(7) (7) 表 9 制備阿魏酸的試驗(yàn)方案 ? ?37 7U 和結(jié)果 No. 配比（ A） 吡啶量（ B） 反應(yīng)時(shí)間（ C） 收率（ Y） 1 (1) 13(2) (3) 2 (2) 19(4) (6) 3 (3) 25(6) (2) 4 (4) 10(1) (5) 5 (5) 16(3) (1) 6 (6) 22(5) (4) 7 (7) 28(7) (7) 14 由于 ? ?4*77U 表是最近由方開泰和李久坤 [14]獲得的，故文獻(xiàn) [1]使用的是 ? ?67 7U 均勻設(shè)計(jì)表，他們的試驗(yàn)方案列于表 9。由它們的使用表中可以查到，當(dāng) s=3 時(shí)，兩個(gè)表的偏差分別為 和，故應(yīng)當(dāng)選用 ? ?4*7 7U 來安排該試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案列于表 8。 2）選擇適合該試驗(yàn)的均勻設(shè)計(jì)表，然后根據(jù)該表的使用表從中選出列號(hào)，將因素分別安排到這些列號(hào)上，并將這些因素的水平按所在列的指示分別對(duì)號(hào)，則試驗(yàn) 就安排好了。其步驟和正交設(shè)計(jì)很相似，但也有一些不同之處。均勻設(shè)計(jì)表還有一些其它的特點(diǎn)，在第三章將進(jìn)一步介紹。當(dāng)水平數(shù)從 9 到 10 時(shí)，試驗(yàn)數(shù)將從 81 增加到 100。如當(dāng)水平數(shù)從 9 水平增加到 10 水平時(shí)，試驗(yàn)數(shù) n 也從 9 增加到10。均勻設(shè)計(jì)表的這一性質(zhì)和正交表有很大的不同，因此，每個(gè)均勻設(shè)計(jì)表必須有一個(gè)附加的使用表。例如用 ? ?6*6 6U 的 1， 3 和 1， 4 列分別畫圖，得圖 8(a)和圖 8(b)。如表 ? ?6*6 6U 的第一列和第三列點(diǎn)成圖 8（ a） . 12 性質(zhì) 1）和 2）反映了 試驗(yàn)安排的“均衡性”，即對(duì)各因素，每個(gè)因素的每個(gè)水平一視同仁。 表 6 ? ?4*7 7U 1 2 3 4 1 1 3 5 7 2 2 6 2 6 3 3 1 7 5 4 4 4 4 4 5 5 7 1 3 6 6 2 6 2 7 7 5 3 1 表 7 ? ?4*6 6U 的使用表 S 列 號(hào) D 2 1 3 3 1 2 3 4 1 2 3 4 均勻設(shè)計(jì)有其獨(dú)特的布（試驗(yàn)）點(diǎn)方式，其特點(diǎn)表現(xiàn)在： 1）每個(gè)因素的每個(gè)水平做一次且僅做一次試驗(yàn)。若用正交表安排三個(gè) 6 水平因素，至少要采用 ? ?3366L ，該表最多能安排三個(gè)因素，可要做 36 次試驗(yàn)，而兩個(gè)表的偏差一個(gè)為 ? ?*6U ，另一個(gè)為 ? ?36L (參見表 23），相差并不十分大。故當(dāng)因素 s較大，且超過 *nU 的使用范圍時(shí)可使用 nU 表。有關(guān) D 的定義和計(jì)算將在第三章介紹。它告訴我們，若有兩個(gè)因素，應(yīng)選用 1， 3 兩列來安排試驗(yàn)；若有三個(gè)因素，應(yīng)選用 1， 2， 3 三列，?，最后 1列 D 表示刻劃均勻度的偏差 (discrepancy)，偏差值越小，表示均勻度越好。 每個(gè)均勻設(shè)計(jì)表都附有一個(gè)使用表，它指示我們?nèi)绾螐脑O(shè)計(jì)表中選用適當(dāng)?shù)牧?，以及由這些列所組成的試驗(yàn)方案的均勻度。通常加“ *”的均勻設(shè)計(jì)表有更好的均勻性，應(yīng)優(yōu)先選用。每一個(gè)均勻設(shè)計(jì)表有一個(gè)代號(hào)? ?sn qU 或 ? ?sn qU* ，其中“ U”表示均勻設(shè)計(jì)，“ n” 表示要做 n 次試驗(yàn)，“ q”表示每個(gè)因素有 q 個(gè)水平，“ s”表示該表有 s 列。附錄Ⅰ給出了 41 個(gè)均勻設(shè)計(jì)表和相應(yīng)的使用表。 均勻設(shè)計(jì)就是只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻散布的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，其原理將在第三章給出。為了保證“整齊可比”的特點(diǎn)，正交設(shè)計(jì)必須至少要求做 q2 次試驗(yàn)。上節(jié)我們提及正交設(shè)計(jì)在挑選代表點(diǎn)時(shí)有兩個(gè)特點(diǎn)：均勻分散，整齊可比。 所有的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法本 質(zhì)上就是在試驗(yàn)的范圍內(nèi)給出挑選代表點(diǎn)的方法。若在一項(xiàng)試驗(yàn)中有 s 個(gè)因素，每個(gè)因素各有 q 水平，用正交試驗(yàn)安排試驗(yàn)，則至少要作 2q 個(gè)試驗(yàn)，當(dāng) q 較大時(shí)， 2q 將更大，使實(shí)驗(yàn)工作者望而生畏。因此整個(gè)設(shè)計(jì)過程我們可用一句話歸納為： “因素順序上列、水平對(duì)號(hào)入座，實(shí) 驗(yàn)橫著作 ”。例如 L9(34)表，若安排四個(gè)因素，第一次實(shí)驗(yàn) A、 B、 C、 D 四因素均取 1 水平，第二次實(shí)驗(yàn) A 因素 1水平， B、 C、 D 取 2 水平， …… 第九次實(shí)驗(yàn) A、 B 因素取 3 水平，C 因素取 2 水平， D 因素取 1 水平。例如某項(xiàng)目考察 4 個(gè)因素 A、 B、 C、D 及 AB 交互作用，各因素均為 2 水平，現(xiàn)選取 L8(27)表，由于AB 兩因素需要觀察其交互作用，故將二者優(yōu)先安排在第 2 列，根據(jù)交互作用表查得 AB 應(yīng)排在第 3 列，于是 C 排在第 4 列，由于 AC 交互在第 5 列， BC 交互作用在第 6 列，雖然未考查 AC與 BC，為避免混雜之嫌， D 就排在第 7 列。由于同水平的正交表有多個(gè)，如 L8(27)、 L12(211)、 L16(215)，一般只要表中列數(shù)比考慮需要觀察的個(gè)數(shù)稍多一點(diǎn)即可，這樣省工省時(shí)。 (3)選定正交表 根據(jù)確定的列數(shù) (c)與水平數(shù) (t)選擇相應(yīng)的正交表。 (2)確定各因素的水平數(shù) 根據(jù)研究目的，一般二水平 (有、無 )可作因素篩選用；也可適用于試驗(yàn)次數(shù)少、分批進(jìn)行的研究。 表頭設(shè)計(jì)的主要步驟如下： (1)確定列數(shù) 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，選擇處理因素與不可忽略的交互作用，明確其共有多少個(gè)數(shù)，如果對(duì)研究中的某些問題尚不太 了解，