【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長(zhǎng)。因其生長(zhǎng)具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾??；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素?？咕V極廣，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。器材：1ml移液槍；鋁鍋；電爐 試劑：NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）M促進(jìn)劑母液（ g／L）實(shí)驗(yàn)步驟： 1．種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO47H2O ，KH2PO4 。先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布?jí)赫ト≈?，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，(NH4)2SO4 3，MgSO47H2O ，α—。配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對(duì)四環(huán)素產(chǎn)量的影響：(1)對(duì)照(不加其他成分)；(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／／L。每?jī)山M配一套。3．滅菌將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30min。同時(shí)滅1ml 剪口移液槍頭、。（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項(xiàng)：1．黃豆餅粉煮沸取汁。2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補(bǔ)充閱讀：工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級(jí)放大的過程，各個(gè)不同的階段對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可?，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無機(jī)氮源。最后一級(jí)的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來加以滿足。實(shí)驗(yàn)二 金霉素鏈霉菌的定向發(fā)酵（驗(yàn)證型）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和掌握無菌操作技術(shù)。掌握定向發(fā)酵四環(huán)素的原理。實(shí)驗(yàn)原理：定向發(fā)酵是指通過改變培養(yǎng)基組分(加入某些物質(zhì))改變微生物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的產(chǎn)物。金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似：R1 R2 Cl H H OH H H金霉菌原是產(chǎn)生金霉素（Chlortetracycline）的菌種，但因金霉素比四環(huán)素只多一個(gè)氯離子，所以只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進(jìn)入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。另外，金色鏈霉菌在30℃以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)；當(dāng)溫度超過35℃時(shí)則只合成四環(huán)素。本實(shí)驗(yàn)中，利用溴離子在生物合成過程中對(duì)氯離子有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用的原理，以及加入2硫醇基苯并噻唑(即M—促進(jìn)劑，分子式：C7H5NS2，通常作為橡膠硫化促進(jìn)劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環(huán)素的產(chǎn)量。材料和試劑：金霉素鏈霉菌：購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（菌種保藏號(hào)：；訂單號(hào)20111133 550元）。實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備工作：配制斜面培養(yǎng)基（可選，1號(hào)培養(yǎng)基由菌種保藏中心提供） g，K2HPO4 g，MgSO47H2O g，（NH4）2HPO4 3 g，瓊脂 15～20 g，定容至1L，pH 7?？扇苄缘矸?0g，KN O3 1g，K2HPO4 ，MgSO47H2O ，NaCl，F(xiàn)eSO47H2O ，定容至1L，pH ~。制備斜面孢子：將保藏的菌種的比例接種于液體培養(yǎng)基中（不加瓊脂的斜面培養(yǎng)基），28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，將活化1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7天，金霉素 土霉素 四環(huán)素待孢子長(zhǎng)成灰色，于4℃冰箱中保藏。種子培養(yǎng)：在斜面上用接種鏟挑取1cm2左右生長(zhǎng)良好的菌體接入裝有50ml四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)20～24h。發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml錐形瓶中（注意：同一處理組用同一瓶種子液接種），230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)5 d。用于后面的測(cè)定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。四環(huán)素的提取和精制（選作）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握沉淀法精制四環(huán)素的原理、方法和基本操作技術(shù)。2 ．熟悉pH 的控制與產(chǎn)量、質(zhì)最的關(guān)系。二、實(shí)驗(yàn)原理四環(huán)素為兩性化合物。當(dāng)溶液pH 等于等電點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素呈游離堿形式，從水溶液中沉淀出來。利用四環(huán)素的這一性質(zhì)，可將四環(huán)素從發(fā)酵液中提取出來。在連續(xù)結(jié)晶過程中，pH 的高低對(duì)產(chǎn)量、質(zhì)量都有一定的影響。 , 在pH ~ 之間，游離堿在水中的溶解度乎不變。若pH 控制在接近等電點(diǎn)時(shí)，沉淀結(jié)品雖然比較完全，收率也高，但此時(shí)會(huì)有大量雜質(zhì)同時(shí)析出，影響產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量；若pH控制得較低一些，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量雖有好處，但沉淀結(jié)晶不夠完全，收率會(huì)低些，影響產(chǎn)量。因此，在選擇沉淀結(jié)晶pH 時(shí)，就必須同時(shí)考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量的效果。在正常情況下。若沉淀結(jié)晶質(zhì)量較差，pH可控制得稍低