【文章內(nèi)容簡介】 、單克隆抗體特點 參考資料 《制藥工藝學(xué)》，陳平等主編，湖北科學(xué)技術(shù)出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》第二版，吳梧桐主編 ， 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》，陳電容，朱照靜主編，人民衛(wèi)生出版社， 2020 《生物合成藥物學(xué)》，褚志義主編 ， 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020 教 學(xué) 進程 第一部分：組織教學(xué)和復(fù)習(xí)上次課主要內(nèi)容 （時間： 5分鐘） 情境導(dǎo)入 ： 通過圖片展開介紹細胞工程制藥技術(shù)的建立和發(fā)展及相關(guān)實驗室設(shè)備與生物反應(yīng)器類型。 設(shè)計意圖： 讓學(xué)生通過學(xué)習(xí)為有計劃、大規(guī)模地培養(yǎng)生物組織和細胞以及獲得生物及其產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。 第二部分：學(xué)習(xí)新內(nèi)容 （時間： 84鐘） 第一節(jié) 概述 細胞工程 的 概念： 所涉及的主要技術(shù)有： 動植物組織和細胞培養(yǎng)技術(shù) 、 細胞融合技術(shù) 、 細胞器移植技術(shù)和細胞重組技術(shù) 、 體外受精技術(shù) 、 染色體工程技術(shù) 、 DNA 重組技術(shù) 第二節(jié) 細胞融合技術(shù) 一、細胞融合技術(shù)的建立和發(fā)展 17 教學(xué) 進程 （續(xù)） （一）細胞融合（ cell fusion)，又稱體細胞雜交（ somatic hybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜 融合形成單個細胞的過程。 （二）細胞融合研究進展 ? 教師活動： 以時間為軸介紹細胞融合研究發(fā)展的過程 細胞融合的意義 二、動物細胞融合和體細胞雜交 （一）促進細胞融合的方法 仙臺病毒法 聚乙二醇（ PEG）法 電融合法 （二）雜交瘤技術(shù) 概念：只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。 單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞 (myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的 B 淋巴細胞 (antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridoma cell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有 B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology ）。 ? 教師活動 ： 詳細講解雜交瘤技術(shù)及單克隆抗體的概念，務(wù)必讓學(xué)生理解，再進一步講解單克隆抗體的制備過程，從而加深學(xué)生的理解程度。 三、植物原生質(zhì)體融合和體細胞雜交 植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細胞融合可用產(chǎn)生遠緣雜種；是目前植物細胞及基因工程的核心技術(shù)。 植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體像正常的植物細胞那樣具有全能性，在一定條件下培養(yǎng)可以重新再生出完整植株。 原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等 過程。 (一 ) 原生質(zhì)體的制備： 材料來源與預(yù)處理： （ 1）材料來源： （ 2）預(yù)處理： 2. 制備原生質(zhì)體的酶類： 3．原生質(zhì)體分離及純化 4．原生質(zhì)體活力測定 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 18 1. 培養(yǎng)方法： （ 1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法， 1. 2%瓊脂。 （ 2）液體培養(yǎng)： 2. 培養(yǎng)條件： 密度： 平板培養(yǎng) 103~104 個 /ml,液體培養(yǎng) 104~105 個 /ml 溫度： 多數(shù)為 2528 oC, 少數(shù) 16~37 oC 光照： 500 lx,18h 或 2800 lx 連續(xù)光照 多數(shù)要求 黑暗或弱光 3. 細胞壁再生及細胞分裂： 愈傷組織或胚狀體形成 5. 植株再生 （三） 原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的： （四） 原生質(zhì)體融合： 在外界因素作用下，兩個或兩個以上植物細胞合并成一個多核細胞的過程稱為植物細胞融合，或植物體細胞雜交。 四、微生物原生質(zhì)體融合 （一）標(biāo)記菌種篩選和穩(wěn)定性鑒定 （二）原生質(zhì)體制備與再生 （三）原生質(zhì)體融合 ? 教師活動： 首先要學(xué)生了解細胞融合是指在立體條件下用人工的方法把兩個或兩個以上的體細胞合并在一起的技術(shù)，因此實用性很強，讓學(xué)生學(xué)會對比學(xué)習(xí)動物細胞、植物與微生物原生質(zhì)體融合的異同和應(yīng)用。 課堂小結(jié)： 細胞融合技術(shù)包括動物細胞融合、植物原生質(zhì)體融合以及微生物原生質(zhì)體融合。 第三部分：布置作業(yè)、說清楚作業(yè)的要求 （時間： 1分鐘） 有關(guān)名詞解釋 雜交瘤技術(shù) 單克隆抗體 細胞融合技術(shù) 原生質(zhì)體融合 簡述分離細胞的方法。 單細胞培養(yǎng)的基本方法有幾種？ 簡述植物原生質(zhì)培養(yǎng)及細胞融合的作用。 教學(xué)后記 19 湖 北 生 物 科 技 職 業(yè) 學(xué) 院 課 時 教 案 講 授 人 方緒鳳 課 時 2學(xué)時 序 號 課題 內(nèi)容 第四章 細胞工程制藥技術(shù) 第三節(jié) 第四節(jié) 教學(xué)時間 教學(xué)方法 課堂講授 教學(xué)課型 理論 □√ 實驗 □ 習(xí)題 □ 實踐 □ 復(fù)習(xí)□ 其它 □ 教學(xué)手段 采用課堂講授方式進行，以 PPT為主，板書為輔 教學(xué)目的 學(xué)會動物細胞培養(yǎng)技術(shù) 學(xué)會植物細胞培養(yǎng)技術(shù) 重點難點 重點：掌握體外細胞培養(yǎng)、培養(yǎng)液的類型和組成；植物細胞培養(yǎng)的特性與營養(yǎng)及植物細胞懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)技術(shù) 難點：動物細胞的培養(yǎng)，植物細胞培養(yǎng)的類型 參考資料 《制藥工藝學(xué)》，陳平等主編，湖北科學(xué)技術(shù)出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》第 二版，吳梧桐主編 ， 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》，陳電容，朱照靜主編，人民衛(wèi)生出版社， 2020 《生物合成藥物學(xué)》，褚志義主編 ， 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020 教學(xué) 進程 第一部分：組織教學(xué)和復(fù)習(xí)上次課主要內(nèi)容 （時間： 5分鐘） 情境導(dǎo)入 ： 學(xué)會了細胞融合技術(shù)，下面就分別介紹動物細胞培養(yǎng)技術(shù)及植物細胞培養(yǎng)技術(shù) 第二部分：學(xué)習(xí)新內(nèi)容 （時間： 84鐘） 第三節(jié) 動物細胞培養(yǎng)技術(shù) 一、 動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 二、 體外細胞培養(yǎng) （一） 體內(nèi)、外細胞的差異 ?教師活動 ： 針對體內(nèi)、外細胞的差異做個比較，讓學(xué)生體會到體 20 教學(xué) 進程 （續(xù)） 外培養(yǎng)需要的技術(shù)和條件。 （二）動物細胞的特點 （三）體外培養(yǎng)動物細胞類型 ?1. 貼附型 ： 貼附于支持物表面，生長中形成匯片。大多數(shù)細胞屬此型。失去在體內(nèi)特有形態(tài)。 成纖維細胞型、上皮細胞型、游走型、多形型 ?2. 懸浮型 ： 懸浮生長，單個分散或成團。各種源自血液的細胞、骨髓、脾細胞。 三、 培養(yǎng)細胞的生存條件 ?培養(yǎng)細胞所需營養(yǎng)物質(zhì) 基本營養(yǎng)：與體內(nèi)相同，包括糖、氨基酸、無機離子、維生素、微量元素（ 1640，F(xiàn)10， F12， DMEM 等等） 生長因子：動物血清（小牛血清，胎牛血清） 基本培養(yǎng)液（ 80～ 90％）血清（ 10～ 20％） 抗生素：雙抗（青霉素 鏈霉素）終濃度為每毫升 100 單位 特殊條件：高糖、胰島素、 PHA?? 根據(jù)自己實驗特殊需要 ?培養(yǎng)環(huán)境 溫度： 35~37℃ 濕度：恒濕 氣體： 95%空氣 /5%CO2， N2 酸堿度： pH ~ （酚紅指示） 滲透壓： =血漿滲透壓 290 Osm/kg 21 支持物：玻璃、塑料、飼養(yǎng)層、微載體 四、動物細胞及組織培養(yǎng) （一）灌注懸浮培養(yǎng) （二）貼壁細胞培養(yǎng) （三）固定化細胞培養(yǎng) 第四節(jié) 植物細胞培養(yǎng)技術(shù) ?植物細胞培養(yǎng)（ plant cell culture）： 指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細胞 (或小細胞團 )進行培養(yǎng)，形成單細無性系或再生植物的技術(shù)。 植物細胞的懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture) ?是指將游離的植物細胞按一定的細胞密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。 ?適宜于大規(guī)模培養(yǎng)，細胞工程產(chǎn)業(yè)的技術(shù)基礎(chǔ)。 ? 教師活動： 學(xué)習(xí)植物細胞培養(yǎng)時，通過對比微生物與植物細胞的形態(tài)、植物細胞培養(yǎng)液的性質(zhì)、植物細胞培養(yǎng)中的傳遞狀態(tài)的不同之處，加深對細胞的營養(yǎng)成分及其培養(yǎng)基也不同的理解。 課堂小結(jié)： 細胞融合技術(shù)，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)、植物細胞培養(yǎng)技術(shù) 第三部分：布置作業(yè)、說清楚作業(yè)的要求 （時間： 1分鐘） 植物體外培養(yǎng)所需要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有哪些？ 血清在動物系八婆培養(yǎng)中的利、弊有哪些？ 與液體培養(yǎng)細胞相比，固定化細胞有哪些？ 教學(xué)后記 22 湖 北 生 物 科 技 職 業(yè) 學(xué) 院 課 時 教 案 講 授 人 方緒鳳 課 時 2學(xué)時 序 號 課題內(nèi)容 第五章 酶工程制藥技術(shù) 第一節(jié) 第二節(jié) 教學(xué)時間 教學(xué)方法 課堂講授 教學(xué)課型 理論 □√ 實驗 □ 習(xí)題 □ 實踐 □ 復(fù)習(xí)□ 其它 □ 教學(xué)手段 采用課堂講授方式進行，以 PPT為主，板書為輔 教學(xué)目的 學(xué)會藥物的酶法生產(chǎn) 酶和細胞的固定化原理與技術(shù) 重點難點 重點：酶工程的基本概念和基本技術(shù)，酶和細胞的固定化技術(shù) 難點：影響工程制藥酶活性的因素及工程制藥酶的來源 參考資料 《制藥工藝學(xué)》，陳平等主編，湖北 科學(xué)技術(shù)出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》第二版，吳梧桐主編 ， 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020 《生物制藥工藝學(xué)》，陳電容，朱照靜主編，人民衛(wèi)生出版社， 2020 《生物合成藥物學(xué)》，褚志義主編 ， 化學(xué)工業(yè)出版社， 2020 教學(xué) 進程 第一部分：組織教學(xué)和復(fù)習(xí)上次課主要內(nèi)容 （時間： 5分鐘） 一、情境導(dǎo)入 ： 設(shè)計意圖： 第二部分：學(xué)習(xí)新內(nèi)容 （時間： 84鐘） 第五章 酶工程制藥技術(shù) 第一節(jié) 概論 一、酶的特性 酶的定義和分類 酶是生物體內(nèi)具有生物催化功能的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。 酶的分類 分為 6 大類 氧化 還原酶 23 教學(xué) 進程 （續(xù)） 轉(zhuǎn)移酶 水解酶 裂合酶 異構(gòu)酶 連接酶（合成酶） 酶的特性 專一性強 催化效率高 反應(yīng)條件溫和 酶活性的調(diào)控機制復(fù)雜 酶的來源 （一）來源類別 （二）利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點 （三）各種能夠生產(chǎn)酶的微生物 酶的生產(chǎn)菌種 對生 產(chǎn)菌種的要求 目前常用的產(chǎn)酶微生物 產(chǎn)酶菌株的制備和優(yōu)化 產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件 菌種的分離篩選 菌種的變異誘導(dǎo)技術(shù) 原生質(zhì)體誘導(dǎo)實際生產(chǎn)例子 蛋白酶產(chǎn)生菌種之間的原生質(zhì)體融合共分為 7步： A、使用的親本菌株 二親本為： （ 1）枯草桿菌 （ 2）地衣芽孢桿菌 二者都是野生型，對利福平和鏈霉素敏感。 B、菌株標(biāo)記的獲得 采用紫外線進行誘變， 篩選營養(yǎng)缺陷型菌株、和抗藥性菌株， 經(jīng)過十代以上傳代，形成穩(wěn)定的突變菌株。 C、原生質(zhì)體的制備 二親本接種入完全培養(yǎng)基， 37℃搖 瓶培養(yǎng) 20 小時 ↓ 離心收集菌體，懸浮于 0。 55mol 的 NaCl 溶液中 24 ↓ 經(jīng) 4000r/min 離心 15 分鐘，洗滌 23次，離心，棄去上清液 ↓ 菌體細胞懸浮于 SMM 緩沖液中 ↓ 加入采用 SMM 液配制的溶菌酶 1000 單位 /ml，置恒溫水浴溶解細胞壁， 定時取樣鏡檢，并用計數(shù)板計數(shù)。 ↓ 待原生質(zhì)球形成之后，以 40006000r/min 離心 2 次，每次 15 分鐘， 洗滌 23次、離心 ↓ 放于無菌蒸餾水中，使原生質(zhì)體膨脹 ↓ 適當(dāng)稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上 ↓ 32℃